วัสดุจากพืชและเชื้อโรค
กลุ่มตัวอย่างพันธุ์ข้าวฟ่างที่เรียกว่า กลุ่มตัวอย่างการปรับปรุงพันธุ์ข้าวฟ่าง (Sorghum Conversion Population หรือ SCP) ได้รับมาจาก ดร. แพท บราวน์ จากมหาวิทยาลัยอิลลินอยส์ (ปัจจุบันอยู่ที่ UC Davis) กลุ่มตัวอย่างนี้ได้รับการอธิบายไว้แล้วก่อนหน้านี้ และเป็นกลุ่มของสายพันธุ์ที่หลากหลายซึ่งได้รับการปรับปรุงพันธุ์ให้ทนต่อช่วงแสงและมีขนาดเล็กกว่า เพื่ออำนวยความสะดวกในการเจริญเติบโตและพัฒนาการของพืชในสภาพแวดล้อมของสหรัฐอเมริกา ในการศึกษาครั้งนี้ใช้สายพันธุ์จากกลุ่มตัวอย่างนี้จำนวน 510 สายพันธุ์ อย่างไรก็ตาม เนื่องจากปัญหาการงอกที่ไม่ดีและปัญหาการควบคุมคุณภาพอื่นๆ ทำให้ไม่ได้ใช้ทุกสายพันธุ์ในการวิเคราะห์ลักษณะทั้งสามประการ ในที่สุด ข้อมูลจาก 345 สายพันธุ์ถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์การตอบสนองต่อไคติน 472 สายพันธุ์สำหรับการตอบสนองต่อ flg22 และ 456 สายพันธุ์สำหรับความต้านทานต่อ TLSบี. คุกกี้สายพันธุ์ LSLP18 ได้รับมาจาก ดร. เบิร์ต บลูห์ม แห่งมหาวิทยาลัยอาร์คันซอ
การวัดการตอบสนองของ MAMP
ในการศึกษาครั้งนี้ใช้ MAMP สองชนิดที่แตกต่างกัน ได้แก่ flg22 (หมายเลขแคตตาล็อก Genscript # RP19986) และไคติน ปลูกต้นข้าวฟ่างในถาดเพาะที่วางบนฐานรองที่บรรจุด้วยดิน (ส่วนผสมดินปลูก Sunshine Redi-Earth Pro 33%) ในเรือนกระจก รดน้ำต้นไม้ในวันก่อนเก็บตัวอย่างเพื่อหลีกเลี่ยงความชื้นในใบมากเกินไปในวันที่เก็บตัวอย่าง
สายพันธุ์ต่างๆ ถูกสุ่มจัดเรียง และด้วยเหตุผลด้านโลจิสติกส์ จึงปลูกเป็นชุดๆ ละ 60 สายพันธุ์ สำหรับแต่ละสายพันธุ์ จะปลูกในกระถาง 3 ใบ โดยแต่ละสายพันธุ์มีเมล็ด 2 เมล็ด ชุดถัดไปจะถูกปลูกทันทีหลังจากที่ชุดก่อนหน้าได้รับการประมวลผลเสร็จสิ้น จนกว่าจะประเมินประชากรทั้งหมดแล้ว การทดลองดำเนินการ 2 รอบสำหรับ MAMP ทั้งสองชนิด โดยมีการสุ่มจัดเรียงจีโนไทป์ใหม่ในแต่ละรอบการทดลอง
การทดสอบ ROS ดำเนินการตามที่ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ โดยสรุปคือ สำหรับแต่ละสายพันธุ์ จะปลูกเมล็ด 6 เมล็ดในกระถาง 3 ใบที่แตกต่างกัน จากต้นกล้าที่ได้ จะคัดเลือก 3 ต้นโดยพิจารณาจากความสม่ำเสมอ ต้นกล้าที่ดูผิดปกติหรือสูงหรือเตี้ยกว่าต้นส่วนใหญ่จะไม่นำมาใช้ ตัดแผ่นใบขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 3 มม. จำนวน 4 แผ่นจากส่วนที่กว้างที่สุดของใบที่ 4 ของต้นข้าวฟ่างอายุ 15 วัน 3 ต้น ตัดแผ่นใบ 1 แผ่นจาก 2 ต้น และ 2 แผ่นจาก 1 ต้น โดยแผ่นที่สองใช้เป็นตัวควบคุมน้ำ (ดูด้านล่าง) นำแผ่นใบแต่ละแผ่นไปลอยในน้ำ 50 ไมโครลิตรในจาน 96 หลุมสีดำ ปิดผนึกด้วยแผ่นอลูมิเนียมเพื่อป้องกันแสง และเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้องข้ามคืน เช้าวันถัดมา ได้เตรียมสารละลายปฏิกิริยาโดยใช้สารเรืองแสงเคมี L-012 (Wako, หมายเลขแคตตาล็อก 120-04891) ความเข้มข้น 2 มก./มล., เอนไซม์ฮอร์สแรดิชเปอร์ออกซิเดส (ชนิด VI-A, Sigma-Aldrich, หมายเลขแคตตาล็อก P6782) ความเข้มข้น 2 มก./มล. และไคติน ความเข้มข้น 100 มก./มล. หรือ Flg22 ความเข้มข้น 2 ไมโครโมลาร์ เติมสารละลายปฏิกิริยานี้ 50 ไมโครลิตรลงในหลุมทดลอง 3 ใน 4 หลุม หลุมที่สี่เป็นหลุมควบคุม โดยเติมสารละลายปฏิกิริยาที่ไม่มี MAMP ลงไป นอกจากนี้ ในแต่ละเพลทยังมีหลุมว่าง 4 หลุมที่บรรจุน้ำเปล่าเท่านั้น
หลังจากเติมสารละลายปฏิกิริยาแล้ว จะทำการวัดค่าการเรืองแสงโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลทแบบหลายการตรวจจับ SynergyTM 2 (BioTek) ทุกๆ 2 นาที เป็นเวลา 1 ชั่วโมง เครื่องอ่านจะทำการวัดค่าการเรืองแสงทุกๆ 2 นาที ตลอด 1 ชั่วโมงนี้ จากนั้นจึงคำนวณผลรวมของค่าที่วัดได้ทั้ง 31 ค่า เพื่อให้ได้ค่าสำหรับแต่ละหลุม ค่าประมาณการตอบสนองต่อ MAMP สำหรับแต่ละจีโนไทป์คำนวณได้จาก (ค่าเฉลี่ยการเรืองแสงของหลุมทดลองทั้งสามหลุม ลบด้วยค่าของหลุมควบคุม) ลบด้วยค่าเฉลี่ยของหลุมว่าง โดยค่าของหลุมว่างจะมีค่าใกล้เคียงกับศูนย์เสมอ
แผ่นใบของนิโคเทียนา เบนทามิอานานอกจากนี้ ยังได้รวมพันธุ์ข้าวฟ่างที่มีการตอบสนองสูง (SC0003) และพันธุ์ข้าวฟ่างที่มีการตอบสนองต่ำ (PI 6069) ไว้เป็นตัวควบคุมในแต่ละเพลท 96 หลุม เพื่อวัตถุประสงค์ในการควบคุมคุณภาพ
บี. คุกกี้การเตรียมเชื้อและการฉีดเชื้อ
บี. คุกกี้เตรียมเชื้อเริ่มต้นตามวิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ โดยสรุปคือ แช่เมล็ดข้าวฟ่างในน้ำเป็นเวลาสามวัน ล้างออก ตักใส่ขวดรูปกรวยขนาด 1 ลิตร แล้วนำไปนึ่งฆ่าเชื้อเป็นเวลาหนึ่งชั่วโมงที่ความดัน 15 psi และอุณหภูมิ 121 °C จากนั้นจึงเติมเชื้อเริ่มต้นประมาณ 5 มิลลิลิตรของเส้นใยที่บดละเอียดจากเชื้อเพาะเลี้ยงสดลงในเมล็ดข้าวฟ่างบี. คุกกี้นำเชื้อรา LSLP18 มาเพาะเลี้ยงในขวดทดลองและทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 2 สัปดาห์ โดยเขย่าขวดทุกๆ 3 วัน หลังจากนั้น 2 สัปดาห์ นำเมล็ดข้าวฟ่างที่ติดเชื้อราไปตากแห้ง แล้วเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส จนกว่าจะนำไปปลูกในแปลง ใช้เชื้อเพาะเลี้ยงชุดเดียวกันตลอดการทดลอง และเตรียมเชื้อเพาะเลี้ยงใหม่ทุกปี สำหรับการปลูกเชื้อ นำเมล็ดข้าวฟ่างที่ติดเชื้อรา 6-10 เมล็ด วางลงบนยอดอ่อนของต้นข้าวฟ่างอายุ 4-5 สัปดาห์ สปอร์ของเชื้อราจะเริ่มก่อให้เกิดการติดเชื้อในต้นข้าวฟ่างอ่อนภายในหนึ่งสัปดาห์
การเตรียมเมล็ดพันธุ์
ก่อนปลูกเมล็ดข้าวฟ่างในแปลง เมล็ดจะถูกเคลือบด้วยสารฆ่าเชื้อรา สารฆ่าแมลง และสารปกป้องเมล็ดพืชผสมกัน โดยมีส่วนประกอบของสารฆ่าเชื้อรา Spirato 480 FS ประมาณ 1%, สารฆ่าเชื้อรา Sebring 480 FS 4% และสารปกป้องเมล็ดพืช Sorpro 940 ES 3% จากนั้นจึงนำเมล็ดไปผึ่งลมให้แห้งเป็นเวลา 3 วัน เพื่อให้เกิดการเคลือบสารผสมนี้บางๆ รอบเมล็ด สารปกป้องเมล็ดพืชนี้ช่วยให้สามารถใช้สารกำจัดวัชพืช Dual Magnum เป็นสารกำจัดวัชพืชก่อนงอกได้
การประเมินความต้านทานต่อโรคจุดใบเป้าหมาย
พันธุ์ SCP ถูกปลูกที่สถานีวิจัยพืชกลางในเมืองเคลย์ตัน รัฐนอร์ทแคโรไลนา ในวันที่ 14-15 มิถุนายน 2560 และ 20 มิถุนายน 2561 โดยใช้แผนการทดลองแบบสุ่มสมบูรณ์ (randomized complete block design) โดยมีการทำซ้ำการทดลอง 2 ครั้งในแต่ละกรณี การทดลองปลูกในแถวเดี่ยวขนาด 1.8 เมตร ความกว้างแถว 0.9 เมตร โดยใช้เมล็ดพันธุ์ 10 เมล็ดต่อแปลง มีการปลูกแถวขอบ 2 แถวรอบนอกของแต่ละการทดลองเพื่อป้องกันผลกระทบจากขอบ การทดลองได้รับการฉีดเชื้อในวันที่ 20 กรกฎาคม 2560 และ 20 กรกฎาคม 2561 ซึ่งในขณะนั้นต้นข้าวฟ่างอยู่ในระยะการเจริญเติบโตที่ 3 การประเมินใช้มาตราส่วนหนึ่งถึงเก้า โดยต้นที่ไม่มีอาการของโรคได้คะแนนเก้า และต้นที่ตายสนิทได้คะแนนหนึ่ง มีการประเมิน 2 ครั้งในปี 2560 และ 4 ครั้งในปี 2561 โดยเริ่มประเมินสองสัปดาห์หลังจากฉีดเชื้อในแต่ละปี sAUDPC (พื้นที่มาตรฐานใต้เส้นโค้งความก้าวหน้าของโรค) คำนวณตามที่ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้
วันที่เผยแพร่: 1 เมษายน 2564