สารกำจัดศัตรูพืชมีบทบาทสำคัญในการแก้ไขปัญหาการขาดแคลนอาหารทั่วโลกและการต่อสู้กับโรคติดต่อในมนุษย์ที่เกิดจากแมลงเป็นพาหะ อย่างไรก็ตาม ปัญหาการดื้อต่อสารกำจัดศัตรูพืชที่เพิ่มมากขึ้นนั้น จำเป็นอย่างยิ่งที่จะต้องค้นพบสารประกอบใหม่ๆ ที่มุ่งเป้าไปที่เป้าหมายที่ยังไม่ได้ใช้ประโยชน์อย่างเต็มที่ ช่องรับสัญญาณศักย์ชั่วคราวของแมลง (TRPV) ได้แก่ ช่องหนานจง (Nan) และช่องที่ไม่ทำงาน (Iav) สามารถสร้างช่องสัญญาณต่างชนิดกัน (Nan-Iav) และไปอยู่บริเวณอวัยวะรับความรู้สึกเชิงกลที่ทำหน้าที่เกี่ยวกับการตอบสนองต่อแรงโน้มถ่วง การได้ยิน และการรับรู้ตำแหน่งของร่างกายในแมลง สารกำจัดศัตรูพืชบางชนิด เช่น อะฟิโดไพร์โรลิโดน (AP) มุ่งเป้าไปที่ Nan-Iav ผ่านกลไกที่ไม่ทราบแน่ชัด AP มีประสิทธิภาพต่อแมลงดูดเลือด (Hemiptera) โดยป้องกันการดูดเลือดด้วยการรบกวนการทำงานของเส้นใย AP สามารถจับกับ Nan ได้เท่านั้น แต่มีเพียง Nan-Iav เท่านั้นที่สามารถโต้ตอบกับสารกระตุ้น รวมถึงนิโคตินาไมด์ (NAM) ที่เกิดขึ้นเองตามธรรมชาติ จึงแสดงกิจกรรมของช่องสัญญาณได้ แม้ว่า Nan-Iav จะมีศักยภาพเป็นเป้าหมายของยาฆ่าแมลง แต่ก็ยังมีความรู้เกี่ยวกับโครงสร้างช่องสัญญาณ ตำแหน่งการจับควบคุม และการควบคุมที่ขึ้นอยู่กับ Ca2+ น้อยมาก ซึ่งเป็นอุปสรรคต่อการพัฒนายาฆ่าแมลงต่อไป ในการศึกษาครั้งนี้ เราใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบแช่แข็ง (cryo-electron microscopy) เพื่อกำหนดโครงสร้างของ Nan-Iav ในแมลงกลุ่ม Hemiptera ทั้งในสภาวะที่ปราศจากลิแกนด์ calmodulin และในสภาวะที่มี AP และ NAM อยู่ที่ขอบเขตของโดเมนไซโตพลาสมิกของ ankyrin repeat (ARD) ที่น่าประหลาดใจคือ เราพบว่าโปรตีน Nan เองสามารถสร้างเพนตาเมอร์ได้ ซึ่งมีความเสถียรโดยปฏิกิริยา ARD ที่เกิดจาก AP การศึกษาครั้งนี้เผยให้เห็นปฏิสัมพันธ์ระดับโมเลกุลระหว่างยาฆ่าแมลงและตัวกระตุ้นกับ Nan-Iav เน้นย้ำถึงความสำคัญของ ARD ในการทำงานและการประกอบช่องสัญญาณ และสำรวจกลไกการควบคุมโดย Ca2+
ท่ามกลางภาวะการเปลี่ยนแปลงสภาพภูมิอากาศโลกที่รุนแรงขึ้นเรื่อยๆ ความมั่นคงทางอาหารทั่วโลกที่เสื่อมถอยลงถือเป็นหนึ่งในความท้าทายสำคัญของศตวรรษที่ 21 ซึ่งส่งผลกระทบต่อเนื่องต่อสังคม1,2รายงานสถานการณ์ความมั่นคงทางอาหารและโภชนาการโลกปี 2023 (SOFI) ขององค์การอนามัยโลกประเมินว่า ประชากรทั่วโลกประมาณ 2.33 พันล้านคนประสบปัญหาความไม่มั่นคงทางอาหารในระดับปานกลางถึงรุนแรง ซึ่งเป็นปัญหาที่มีมาอย่างยาวนาน3,4น่าเสียดายที่คาดการณ์ว่าผลผลิตทางการเกษตรประมาณ 20% ถึง 30% หรือมากกว่านั้น สูญเสียไปในแต่ละปีเนื่องจากศัตรูพืชและเชื้อโรค และคาดว่าภาวะโลกร้อนจะยิ่งทำให้ศัตรูพืชดื้อยาและพืชผลทางการเกษตรอ่อนแอลง4,5,6,7,8การพัฒนาสารกำจัดศัตรูพืชมีความสำคัญอย่างยิ่ง ไม่เพียงแต่เพื่อปกป้องพืชผลจากศัตรูพืชและลดการแพร่กระจายของเชื้อโรคที่แพร่โดยพาหะเท่านั้น แต่ยังรวมถึงการต่อสู้กับโรคติดต่อในมนุษย์ที่แพร่โดยพาหะ เช่น ไข้เลือดออก มาลาเรีย และโรคชากาส ซึ่งกำลังดื้อต่อสารกำจัดศัตรูพืชมากขึ้นเรื่อยๆ5,9,10,11
ในบรรดาเป้าหมายหลักของยาฆ่าแมลงที่มีฤทธิ์ต่อระบบประสาท ช่อง TRPV แบบเฮเทอโรเตตราเมอริก Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) ถือเป็นกลุ่มเป้าหมายของยาฆ่าแมลงกลุ่มหนึ่งที่เพิ่งถูกค้นพบในช่วงทศวรรษที่ผ่านมา ซึ่งรวมถึงยาฆ่าแมลงที่มีจำหน่ายในเชิงพาณิชย์ เช่น อิมิดาคลอพริดและไพราคลอสโทรบิน12,13,14สารฆ่าแมลงกึ่งสังเคราะห์อะฟิโดไพโรลิเฟน (AP) เป็นผลิตภัณฑ์ที่ได้รับการพัฒนาและวางจำหน่ายในเชิงพาณิชย์เมื่อไม่นานมานี้ โดยมีส่วนประกอบหลักคือสารฆ่าแมลงออกฤทธิ์ Inscalis® ซึ่งจับกับ AP ในระดับความเข้มข้นต่ำกว่านาโนโมลาร์15AP มีความเป็นพิษเฉียบพลันต่ำต่อแมลงผสมเกสร แมลงที่เป็นประโยชน์ และสิ่งมีชีวิตอื่นๆ ที่ไม่ใช่เป้าหมาย และเมื่อใช้ตามคำแนะนำบนฉลาก จะช่วยลดแรงกดดันต่อการดื้อยาฆ่าแมลงชนิดอื่นๆ ได้16,17,18Nan และ Iav มีการกระจายตัวอย่างกว้างขวางในแมลงหลายชนิด มีการแสดงออกร่วมกันเฉพาะในเซลล์ประสาทรับแรงยืดของหนวดและแขนขา และมีความสำคัญต่อการได้ยิน การรับรู้แรงโน้มถ่วง และการรับรู้ตำแหน่งของร่างกาย13,16,19,20,21,22AP, อิมิดาคลอพริด และไพราคลอสโทรบิน กระตุ้นคอมเพล็กซ์ Nan-Iav ผ่านกลไกเฉพาะ ซึ่งท้ายที่สุดแล้วจะยับยั้งการส่งสัญญาณรับรู้ตำแหน่งของร่างกาย13,16,23ในแมลงดูดและกัดกิน (กลุ่ม Hemiptera) เช่น เพลี้ยและแมลงหวี่ขาว การสูญเสียการรับรู้ตำแหน่งของร่างกายจะทำให้ความสามารถในการกินอาหารลดลง จนนำไปสู่ความตายในที่สุด13,24ที่น่าสนใจคือ AP มีความสัมพันธ์สูงกับสารประกอบ Nan-Iav และมีความสัมพันธ์ต่ำกับ Nan เพียงอย่างเดียว การจับกันระหว่าง AP กับ Nan-Iav ทำให้เกิดกระแสไฟฟ้า แต่การจับกับ Nan เพียงอย่างเดียวไม่กระตุ้นการทำงานของช่องสัญญาณ และ Iav เองก็ไม่จับกับ AP เลย16สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่า Nan และ Iav อาจจับกันเพื่อสร้างคอมเพล็กซ์ช่องสัญญาณ Nan-Iav ที่แตกต่างกัน (เช่น ด้วยอัตราส่วนสัดส่วนทางเคมีที่แตกต่างกัน หรือการจัดเรียงที่แตกต่างกันภายในอัตราส่วนสัดส่วนทางเคมีเดียวกัน) หรือ AP อาจจับกับหลายตำแหน่ง นอกจากนี้ สารกระตุ้นตามธรรมชาติอย่างนิโคตินาไมด์ (NAM) จับกับ Nan-Iav ของแมลงหวี่ด้วยความสัมพันธ์ระดับไมโครโมลาร์ แสดงผลคล้ายกับของเพลี้ย (AP) ในหลอดทดลอง16.25และยับยั้งการสืบพันธุ์และการกินอาหารของเพลี้ย ซึ่งในที่สุดจะนำไปสู่ความตายของเพลี้ยเหล่านั้น25,26ข้อมูลเหล่านี้ก่อให้เกิดคำถามมากมาย ตัวอย่างเช่น ยังไม่ชัดเจนว่าเฮเทอโรไดเมอร์ Nan-Iav เกิดขึ้นได้อย่างไร ตำแหน่งการจับใดที่ใช้ในการปรับเปลี่ยนโมเลกุลขนาดเล็ก และโมเลกุลขนาดเล็กเหล่านี้ควบคุมการทำงานของช่องสัญญาณโดยการยับยั้งการรับรู้ตำแหน่งของร่างกายได้อย่างไร นอกจากนี้ เหตุผลที่ Nan เองไม่ทำงานและมีความสัมพันธ์ต่ำกับ AP ในขณะที่เฮเทอโรไดเมอร์ Nan-Iav ทำงานและจับกับ AP ด้วยความสัมพันธ์ที่สูงกว่า ยังคงไม่ชัดเจน สุดท้ายนี้ ยังมีข้อมูลน้อยมากเกี่ยวกับการควบคุมการทำงานของ Nan-Iav ที่ขึ้นอยู่กับ Ca2+ และวิธีการที่มันถูกรวมเข้ากับกระบวนการส่งสัญญาณประสาท13,21
ในการศึกษาครั้งนี้ เราได้ผสมผสานเทคนิคกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบแช่แข็ง (cryo-electron microscopy) สรีรวิทยาไฟฟ้า (electrophysiology) และการจับกับสารกัมมันตรังสี (radioligand binding) เพื่อไขปริศนาการประกอบตัวของ Nan-Iav และกลไกการจับกับสารควบคุมโมเลกุลขนาดเล็ก นอกจากนี้ เรายังตรวจพบแคลโมดูลิน (CaM) ที่จับกับ Iav และ Nan pentamer ที่เสถียรด้วย AP อย่างถาวร ผลลัพธ์เหล่านี้ให้ข้อมูลเชิงลึกที่สำคัญเกี่ยวกับการควบคุมไอออนแคลเซียมในช่องสัญญาณ การประกอบช่องสัญญาณ และปัจจัยที่กำหนดความสัมพันธ์ในการจับกับสารควบคุม ที่สำคัญกว่านั้น เราได้ยืนยันว่า ARD มีบทบาทสำคัญในกระบวนการเหล่านี้ การศึกษาของเราเกี่ยวกับช่องสัญญาณแมลงที่สมบูรณ์ซึ่งจับกับสารกำจัดศัตรูพืชทางการเกษตรที่เกี่ยวข้อง27, 28, 29เปิดโอกาสสำหรับการพัฒนาอุตสาหกรรมยาฆ่าแมลง ปรับปรุงประสิทธิภาพและความจำเพาะของยาฆ่าแมลง และช่วยให้สามารถนำสารประกอบที่มุ่งเป้าไปที่ TRPV ไปใช้กับสัตว์ชนิดอื่น ๆ เพื่อแก้ไขปัญหาความมั่นคงทางอาหารทั่วโลกและการแพร่กระจายของโรคที่เกิดจากพาหะนำโรค
นอกจากนี้ เรายังพบว่า Nan-Iav ถูกควบคุมโดย Ca2+ และกลไกการควบคุมนั้นเกิดขึ้นโดยอาศัย CaM ที่จับอยู่ตลอดเวลา ที่สำคัญ การควบคุม Nav โดย CaM ที่ขึ้นอยู่กับ Ca2+ นี้ แตกต่างอย่างมีนัยสำคัญจากกลไกการควบคุมของช่องไอออนอื่นๆ (เช่น ช่อง Na+ ที่ควบคุมด้วยแรงดันไฟฟ้า และช่อง TRPV5/6)52,53,54,55,56,57ในช่อง Nav1.2 โดเมน C-terminal ของ CaM จะเชื่อมต่อแบบเกลียวกับโดเมน C-terminal (CTD) และ Ca2+ จะกระตุ้นให้โดเมน N-terminal ของมันจับกับส่วนปลายของ CTD56ในช่อง TRPV5/6 โดเมน C-terminal ของ CaM จะจับกับ CTH และ Ca2+ จะกระตุ้นให้โดเมน N-terminal ของมันยื่นขึ้นไปในรูพรุน ทำให้ปิดกั้นการซึมผ่านของไอออนบวก53,54เราเสนอแบบจำลองสำหรับการทำงานของ Nan-Iav-CaM ที่ควบคุมโดย Ca2+ (รูปที่ 4h) ในแบบจำลองนี้ โดเมน N-terminal ของ CaM จะจับกับโดเมน C-terminal (CTH) ของ Iav อย่างต่อเนื่อง ในสภาวะพัก (ความเข้มข้นของ [Ca2+] ต่ำ) โดเมน C-terminal ของ CaM จะมีปฏิสัมพันธ์กับ Nan ทำให้โครงสร้าง ARD มีเสถียรภาพ และส่งเสริมการเปิดช่องสัญญาณ การจับของสารกระตุ้น/ยาฆ่าแมลงกับช่องสัญญาณจะทำให้รูพรุนเปิดออก นำไปสู่การไหลเข้าของ Ca2+ จากนั้น Ca2+ จะจับกับ CaM ทำให้โดเมน C-terminal แยกตัวออกจาก ARD ของ Nan เนื่องจาก1การปิดกั้นการจับของ CaM จะทำให้ผลการยับยั้งของ Ca2+ หายไปโดยสิ้นเชิง การแยกตัวนี้จึงปรับเปลี่ยนการเคลื่อนที่ของ ARD ทำให้เกิดการยับยั้งหรือการลดความไวที่ขึ้นอยู่กับ Ca2+ การฟื้นตัวอย่างรวดเร็วของกระแสช่องสัญญาณหลังจากการชะล้างไอออนแคลเซียม (รูปที่ 4g) แสดงให้เห็นว่ากลไกนี้ช่วยให้เกิดการตอบสนองอย่างรวดเร็วต่อสัญญาณประสาทที่เกิดจาก Ca2+ นอกจากนี้ ยังมีรายงานว่าบริเวณปลาย C ของ Iav ซึ่งยังไม่เป็นที่เข้าใจอย่างถ่องแท้ มีบทบาทอื่นๆ ในการกำหนดเป้าหมายช่องสัญญาณและการควบคุมกระแสไฟฟ้า21
สุดท้ายนี้ งานวิจัยของเราได้นำเสนอโครงสร้างความละเอียดสูงของสารฆ่าแมลง-ช่องสัญญาณ TRP ที่ซับซ้อน ซึ่งมีความสำคัญทางการเกษตร—ซึ่งเป็นการค้นพบที่ไม่เคยมีใครรู้มาก่อน ที่สำคัญคือ เราได้ศึกษาลักษณะโครงสร้างและหน้าที่ของช่องสัญญาณในเซลล์มนุษย์ (HEK293S GnTi–) แทนที่จะเป็นเซลล์แมลง ท่ามกลางปัญหาการดื้อยาฆ่าแมลงที่เพิ่มมากขึ้นและความกดดันอย่างต่อเนื่องต่อความมั่นคงทางอาหารและเชื้อโรค งานวิจัยของเราให้ข้อมูลสำคัญที่จะช่วยอำนวยความสะดวกในการพัฒนาสารฆ่าแมลงชนิดใหม่เพื่อประโยชน์ต่อสุขภาพของมนุษย์และความมั่นคงทางอาหารทั่วโลก งานวิจัยหลายชิ้นแสดงให้เห็นว่าสารฆ่าแมลง เช่น AP มีประสิทธิภาพในการกำจัดศัตรูพืชบางชนิดเมื่อใช้ตามคำแนะนำบนฉลาก และมีความเป็นพิษเฉียบพลันต่ำต่อแมลงผสมเกสรที่เป็นประโยชน์ ซึ่งแสดงให้เห็นถึงความปลอดภัยต่อสิ่งแวดล้อม13,16นอกจากนี้ การทดสอบอนุพันธ์ของ AP บางชนิดกับยุงแสดงให้เห็นว่าในที่สุดยุงจะสูญเสียความสามารถในการบิน การทำความเข้าใจว่าสารประกอบปรับเปลี่ยนเหล่านี้จับกับ Nan-Iav ได้อย่างไร จะช่วยให้สามารถปรับเปลี่ยนสารประกอบที่มีอยู่หรือพัฒนาสารประกอบใหม่เพื่อให้มีประสิทธิภาพมากขึ้นและแม่นยำการควบคุมศัตรูพืช การศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่าส่วนต่อประสาน Nan-Iav ARD มีความสำคัญไม่เพียงแต่ในการควบคุมกิจกรรมของสารประกอบภายในร่างกาย สารกำจัดศัตรูพืช และ Ca2+-CaM เท่านั้น แต่ยังรวมถึงการประกอบช่องไอออนด้วย เราเสนอแนะว่าการขัดขวางการประกอบเฮเทอโรไดเมอร์ด้วยโมเลกุลขนาดเล็กอาจเป็นแนวทางที่โดดเด่นและมีแนวโน้มที่ดีสำหรับการพัฒนาสารยับยั้งช่องไอออน
จากยีนออร์โธล็อกัสทั้งแปดยีน ยีนแบบเต็มความยาวของด้วงสีน้ำตาล (Halyomorpha halys) สายพันธุ์หนานชุงและยีนอินแอคทีฟถูกคัดเลือก เนื่องจากแสดงความเสถียรที่ดีเยี่ยมในสารซักฟอก ยีนที่สังเคราะห์ขึ้นได้รับการปรับให้เหมาะสมกับรหัสพันธุกรรมสำหรับการแสดงออกในมนุษย์ และโคลนลงในเวกเตอร์ pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) โดยใช้ตำแหน่งตัดจำเพาะ XhoI และ EcoRI ซึ่งทำให้มั่นใจได้ว่าโคลนอยู่ในเฟรมเดียวกันกับแท็ก GFP-FLAG-10xHis และ mCherry-FLAG-10xHis ที่ปลาย C-terminus ซึ่งจะถูกตัดโดยโปรตีเอส HRC-3C (PPX) ทำให้สามารถแสดงออกได้อย่างอิสระการแสดงออกไพรเมอร์ที่ใช้ในการโคลนยีน Nanchung และ Inactive ลงในเวกเตอร์ pBacMam มีดังต่อไปนี้:
ภาพถ่ายจุลภาคของอนุภาคแต่ละตัวได้มาจากการใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่านแสง Titan Krios G2 (FEI) ที่ติดตั้งกล้อง K3 และตัวกรองพลังงาน Gatan BioQuantum กล้องจุลทรรศน์ทำงานที่ 300 keV โดยตั้งค่าพลังงานไว้ที่ 20 eV ขนาดพิกเซลของตัวอย่าง 1.08 Å/พิกเซล (กำลังขยายที่ระบุ 81,000 เท่า) และค่าความเบลอของภาพอยู่ในช่วง -0.8 ถึง -2.2 μm การบันทึกวิดีโอทำที่ 40 เฟรมต่อวินาทีโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ Latitude S (Gatan) ด้วยอัตราปริมาณรังสีที่ระบุ 25 e–px−1 s−1 เวลาในการเปิดรับแสง 2.4 วินาที และปริมาณรังสีรวมประมาณ 60 e–Å−2
การแก้ไขการเคลื่อนไหวที่เกิดจากลำแสงและการถ่วงน้ำหนักปริมาณรังสีดำเนินการบนฟิล์มโดยใช้ MotionCor2 ใน RELION 4.061 การประมาณค่าพารามิเตอร์ฟังก์ชันการถ่ายโอนความคมชัด (CTF) ดำเนินการใน cryoSPARC โดยใช้วิธีการประมาณค่า CTF แบบอิงแพทช์62 ภาพถ่ายจุลทรรศน์ที่มีความละเอียดในการปรับ CTF ≥4 Å จะถูกยกเว้นจากการวิเคราะห์ในภายหลัง โดยทั่วไปแล้ว จะใช้ภาพถ่ายจุลทรรศน์จำนวน 500–1000 ภาพสำหรับการเลือกจุดใน cryoSPARC ตามด้วยการจำแนกประเภท 2 มิติหลายรอบหลังจากกรองเพื่อให้ได้ภาพอ้างอิงที่ชัดเจนสำหรับการเลือกอนุภาคแบบอิงแม่แบบ จากนั้นอนุภาคจะถูกแยกออกโดยใช้กล่องขอบเขต 64 พิกเซลและการรวมกลุ่ม 4 เท่า การจำแนกประเภท 2 มิติหลายรอบจะดำเนินการเพื่อลบหมวดหมู่อนุภาคที่ไม่ต้องการ โมเดล 3 มิติเริ่มต้นจะถูกสร้างขึ้นใหม่โดยใช้การสร้างใหม่แบบ ab initio และปรับปรุงโดยใช้การปรับปรุงแบบไม่สม่ำเสมอใน cryoSPARC การจำแนกประเภท 3 มิติจะดำเนินการใน cryoSPARC หรือ RELION โดยพิจารณาจากความไม่สม่ำเสมอของ ARD ไม่พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญของโดเมนเยื่อหุ้มเซลล์ อนุภาคได้รับการปรับปรุงโดยใช้วิธี C1 และ C2 อนุภาคที่มีความละเอียด C2 สูงกว่าถือว่าสมมาตรเมื่อเทียบกับ C2 และนำเข้าสู่ RELION เพื่อทำการปรับปรุงแบบเบย์เซียน จากนั้นอนุภาคจะถูกส่งกลับไปยัง cryoSPARC เพื่อทำการปรับปรุงแบบไม่สม่ำเสมอและเฉพาะที่ขั้นสุดท้าย ความละเอียดและจำนวนอนุภาคขั้นสุดท้ายแสดงในตารางที่ 1
ในการประมวลผลเพนทาเมอร์ Nan+AP เราได้สำรวจวิธีการต่างๆ เพื่อปรับปรุงความละเอียดของโดเมนเยื่อหุ้มเซลล์ (โดยเฉพาะบริเวณรูพรุน) เช่น การลบสัญญาณและการปิดบัง TMD อย่างไรก็ตาม ความพยายามเหล่านี้ไม่ประสบความสำเร็จเนื่องจากความไม่เป็นระเบียบอย่างมากในบริเวณรูพรุนและความไม่สม่ำเสมอโดยรวมของ TMD ความละเอียดสุดท้ายคำนวณโดยใช้มาสก์ที่สร้างขึ้นโดยอัตโนมัติโดยวิธีการประมวลผลแบบไม่สม่ำเสมอใน cryoSPARC โดยมุ่งเป้าไปที่บริเวณ ARD เป็นหลัก ซึ่งทำให้ได้ความละเอียดสูงกว่าโดเมนเยื่อหุ้มเซลล์ (โดยเฉพาะบริเวณ VSLD) อย่างมีนัยสำคัญ
แบบจำลอง de novo เริ่มต้นของรูปแบบ apo ของแบคทีเรีย Nanchung และ Inactive ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ Coot63 และแบบจำลองของแบคทีเรีย Nan และ Iav ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ AlphaFold264 เพื่อระบุบริเวณที่มีความน่าเชื่อถือต่ำ การสร้างแบบจำลองแคลโมดูลินนั้นอิงตามการปรับแบบ rigid-body ของแบบจำลองที่จับกับ Ca2+ และแบบจำลองที่ปราศจาก Ca2+ ใน PDB accessions 4JPZ56 และ 1CFD65 ตามลำดับ แบบจำลองได้รับการปรับปรุงโดยใช้การปรับแต่งทรงกลมเพื่อให้แน่ใจว่ามีสเตอริโอเคมีที่ถูกต้องและรูปทรงเรขาคณิตที่ดี จากนั้นฟอสฟาติดิลโคลีน ฟอสฟาติดิลเอทานอลามีน และฟอสฟาติดิลเซอรีนถูกสร้างขึ้นเป็นความหนาแน่นของลิปิดที่กำหนดไว้อย่างดี และลิแกนด์ NAM และ AP ถูกวางไว้ในความหนาแน่นที่สอดคล้องกันใน tight junctions ไฟล์ข้อจำกัดถูกสร้างขึ้นจากสตริง SMILES ของไอโซฟอร์มโดยใช้ eLBOW ใน PHENIX66 ในที่สุด โมเดลต่างๆ ก็ได้รับการปรับปรุงในพื้นที่จริงใน PHENIX โดยใช้การค้นหากริดเฉพาะที่และการลดค่าต่ำสุดทั่วโลกพร้อมข้อจำกัดโครงสร้างทุติยภูมิ เซิร์ฟเวอร์ MolProbity ถูกใช้สำหรับการปรับปรุงโมเดลและการวิเคราะห์โครงสร้าง และภาพประกอบต่างๆ ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ PyMOL และ UCSF Chimera X 67,68,69 การวิเคราะห์รูรับแสงดำเนินการโดยใช้เซิร์ฟเวอร์ HOLE70 และการทำแผนที่การอนุรักษ์ลำดับดำเนินการโดยใช้เซิร์ฟเวอร์ Consurf71
การวิเคราะห์ทางสถิติได้ดำเนินการโดยใช้ Igor Pro 6.2, Excel Office 365 และ GraphPad Prism 7.0 ข้อมูลเชิงปริมาณทั้งหมดแสดงในรูปค่าเฉลี่ย ± ค่าความคลาดเคลื่อนมาตรฐาน (SEM) ใช้การทดสอบ t ของนักเรียน (แบบสองด้าน ไม่จับคู่) เพื่อเปรียบเทียบสองกลุ่ม ใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว (ANOVA) ตามด้วยการทดสอบหลังการวิเคราะห์ของ Dunnett เพื่อเปรียบเทียบหลายกลุ่ม *P< 0.05, **P< 0.01 และ ***Pค่า p < 0.001 ถือว่ามีความสำคัญทางสถิติ ขึ้นอยู่กับการกระจายของข้อมูล ค่า Kd, Ki และช่วงความเชื่อมั่น 95% แบบไม่สมมาตร คำนวณโดยใช้ GraphPad Prism 10
สำหรับรายละเอียดเพิ่มเติมเกี่ยวกับวิธีการศึกษา โปรดดูบทสรุปรายงาน Nature Portfolio ที่เชื่อมโยงอยู่ในบทความนี้
แบบจำลองเริ่มต้นสร้างขึ้นโดยใช้แบบจำลองแคลโมดูลินจากฐานข้อมูล PDB 4JPZ และ 1CFD พิกัดได้ถูกฝากไว้ในธนาคารข้อมูลโปรตีน (PDB) ภายใต้หมายเลขการเข้าถึง 9NVN (Nan-Iav-CaM ที่ไม่มีลิแกนด์), 9NVO (Nan-Iav-CaM ที่จับกับนิโคตินาไมด์), 9NVP (Nan-Iav-CaM ที่จับกับนิโคตินาไมด์และ EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM ที่จับกับอะเฟนิโดลไพร์โรลลีนและแคลเซียม), 9NVR (Nan-Iav-CaM ที่จับกับอะเฟนิโดลไพร์โรลลีนและ EDTA) และ 9NVS (Nan เพนตาเมอร์ที่จับกับอะเฟนิโดลไพร์โรลลีน) ภาพถ่ายจากกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบแช่แข็ง (cryo-electron microscopy) ที่เกี่ยวข้องได้ถูกจัดเก็บไว้ในฐานข้อมูลกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน (Electron Microscopy Database, EMDB) ภายใต้หมายเลขการเข้าถึงต่อไปนี้: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM ที่ไม่มีลิแกนด์), EMD-49845 (Nan-Iav-CaM คอมเพล็กซ์กับนิโคตินาไมด์), EMD-49846 (Nan-Iav-CaM คอมเพล็กซ์กับนิโคตินาไมด์และ EDTA), EMD-49847 (Nan-Iav-CaM คอมเพล็กซ์กับอะฟิโดไพร์โรลลีนและแคลเซียม), EMD-49848 (Nan-Iav-CaM คอมเพล็กซ์กับอะฟิโดไพร์โรลลีนและ EDTA) และ EMD-49849 (Nan pentamer คอมเพล็กซ์กับอะฟิโดไพร์โรลลีน) ข้อมูลดิบสำหรับการวิเคราะห์การทำงานได้ถูกนำเสนอในบทความนี้
วันที่โพสต์: 28 มกราคม 2026