ยาถ่ายพยาธิ N,N-diethyl-m-toluamide (ดีอีท) ได้รับการรายงานว่ายับยั้ง AChE (อะเซทิลโคลีนเอสเทอเรส) และมีคุณสมบัติก่อมะเร็งได้เนื่องจากหลอดเลือดขยายตัวมากเกินไป ในเอกสารฉบับนี้ เราแสดงให้เห็นว่า DEET กระตุ้นเซลล์เยื่อบุผนังหลอดเลือดโดยเฉพาะ ซึ่งส่งเสริมการสร้างหลอดเลือดใหม่ จึงทำให้เนื้องอกเติบโตมากขึ้น DEET กระตุ้นกระบวนการของเซลล์ที่นำไปสู่การสร้างหลอดเลือดใหม่ รวมทั้งการแพร่กระจาย การอพยพ และการยึดเกาะ ซึ่งเกี่ยวข้องกับการผลิต NO ที่เพิ่มขึ้นและการแสดงออกของ VEGF ในเซลล์เยื่อบุผนังหลอดเลือด การปิดเสียง M3 หรือการใช้สารยับยั้ง M3 ทางเภสัชวิทยาช่วยขจัดผลกระทบเหล่านี้ทั้งหมด ซึ่งแสดงให้เห็นว่าการสร้างหลอดเลือดใหม่ที่เกิดจาก DEET นั้นไวต่อ M3 การทดลองที่เกี่ยวข้องกับการส่งสัญญาณแคลเซียมในเซลล์เยื่อบุผนังหลอดเลือดและเซลล์ HEK ที่มีการแสดงออกของตัวรับ M3 มากเกินไป รวมถึงการศึกษาการจับและการเชื่อมต่อ แสดงให้เห็นว่า DEET ทำหน้าที่เป็นตัวปรับเปลี่ยนอัลโลสเตอริกของตัวรับ M3 นอกจากนี้ DEET ยังยับยั้ง AChE ส่งผลให้เพิ่มการดูดซึมของอะเซทิลโคลีนและการจับกับตัวรับ M3 และเพิ่มผลการสร้างเส้นเลือดใหม่ผ่านการควบคุมอัลโลสเตอริก
EC หลักถูกแยกจากหลอดเลือดแดงใหญ่ของหนูสวิส วิธีการสกัดได้รับการดัดแปลงจากโปรโตคอล Kobayashi 26 EC ของหนูได้รับการเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ EBM-2 ที่เสริมด้วย FBS ที่ทำให้ไม่ทำงานด้วยความร้อน 5% จนถึงขั้นตอนที่สี่
ผลของ DEET ความเข้มข้นสองระดับต่อการแพร่กระจายของ HUVEC, U87MG หรือ BF16F10 ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ชุด CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026) โดยสรุป เซลล์ 5.103 เซลล์ต่อหลุมถูกเพาะในแผ่น 96 หลุม ปล่อยให้เกาะติดข้ามคืน จากนั้นจึงบำบัดด้วย DEET เป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจากนำอาหารเลี้ยงเชื้อออกแล้ว ให้เติมสารละลายยึดสีย้อมลงในแต่ละหลุมของไมโครเพลต แล้วฟักเซลล์ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาที ระดับการเรืองแสงถูกกำหนดโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลตหลายโหมด Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, เยอรมนี) ที่ติดตั้งฟิลเตอร์เร้าแสง 485 นาโนเมตรและฟิลเตอร์ปล่อยแสง 530 นาโนเมตร
เพาะ HUVEC ในจาน 96 หลุมที่มีความหนาแน่น 104 เซลล์ต่อหลุม เซลล์ได้รับการบำบัดด้วย DEET เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ความสามารถในการมีชีวิตของเซลล์ได้รับการประเมินโดยใช้การทดสอบ MTT แบบวัดสี (Sigma-Aldrich, M5655) ค่าความหนาแน่นทางแสงได้รับจากเครื่องอ่านไมโครเพลตแบบหลายโหมด (Mithras LB940) ที่ความยาวคลื่น 570 นาโนเมตร
ผลของ DEET ได้รับการศึกษาโดยใช้การทดสอบการสร้างหลอดเลือดใหม่ในหลอดทดลอง การรักษาด้วย DEET ความเข้มข้น 10-8 M หรือ 10-5 M ช่วยเพิ่มการสร้างเส้นเลือดฝอยใน HUVEC (รูปที่ 1a, b, แถบสีขาว) เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม การรักษาด้วย DEET ความเข้มข้นตั้งแต่ 10-14 ถึง 10-5 M แสดงให้เห็นว่าการสร้างเส้นเลือดฝอยถึงจุดคงที่ที่ DEET ความเข้มข้น 10-8 M (รูปเสริม S2) ไม่พบความแตกต่างที่สำคัญในผลการสร้างหลอดเลือดใหม่ในหลอดทดลองของ HUVEC ที่ได้รับการรักษาด้วย DEET ในช่วงความเข้มข้น 10-8 M และ 10-5 M
เพื่อตรวจสอบผลของ DEET ต่อการสร้างหลอดเลือดใหม่ เราได้ทำการศึกษาการสร้างหลอดเลือดใหม่ในร่างกาย หลังจากผ่านไป 14 วัน หนูที่ได้รับการฉีดเซลล์เยื่อบุผนังหลอดเลือดที่เพาะเลี้ยงไว้ล่วงหน้าด้วย DEET 10-8 M หรือ 10-5 M พบว่ามีปริมาณฮีโมโกลบินเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 1c แถบสีขาว)
นอกจากนี้ ยังมีการศึกษาการสร้างหลอดเลือดใหม่ที่เกิดจาก DEET ในหนูที่มีเซลล์ Xenograft U87MG ซึ่งฉีด DEET ทุกวัน (ฉีดเข้าช่องท้อง) ในปริมาณที่ทราบกันว่าสามารถกระตุ้นความเข้มข้นในพลาสมา 10-5 M ซึ่งถือว่าปกติในมนุษย์ที่ได้รับสารนี้ ในการศึกษา 23 ครั้ง เนื้องอกที่ตรวจพบได้ (เช่น เนื้องอก >100 มม.3) ถูกสังเกต 14 วันหลังจากฉีดเซลล์ Xenograft U87MG เข้าไปในหนู ในวันที่ 28 การเติบโตของเนื้องอกเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในหนูที่ได้รับการรักษาด้วย DEET เมื่อเทียบกับหนูในกลุ่มควบคุม (รูปที่ 1d, สี่เหลี่ยม) นอกจากนี้ การย้อม CD31 ของเนื้องอกยังแสดงให้เห็นว่า DEET เพิ่มพื้นที่ของเส้นเลือดฝอยอย่างมีนัยสำคัญแต่ไม่เพิ่มความหนาแน่นของไมโครเวสเซล (รูปที่ 1e–g)
เพื่อพิจารณาบทบาทของตัวรับมัสคารินิกในการแบ่งตัวที่เกิดจาก DETA จะใช้ DETA ความเข้มข้น 10-8 M หรือ 10-5 M ในการมีอยู่ของ pFHHSiD (10-7 M ซึ่งเป็นตัวต่อต้านตัวรับ M3 แบบเลือกสรร) การรักษา HUVEC pFHHSiD ปิดกั้นคุณสมบัติการแบ่งตัวของ DETA ได้อย่างสมบูรณ์ที่ความเข้มข้นทั้งหมด (ตารางที่ 1)
ภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ เราได้ตรวจสอบด้วยว่า DEET จะเพิ่มความยาวของเส้นเลือดฝอยในเซลล์ HUVEC หรือไม่ ในทำนองเดียวกัน pFHHSiD ป้องกันความยาวของเส้นเลือดฝอยที่เกิดจาก DEET ได้อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 1a, b, แถบสีเทา) นอกจากนี้ ยังมีการทดลองที่คล้ายกันกับ M3 siRNA แม้ว่า siRNA ควบคุมจะไม่มีประสิทธิภาพในการส่งเสริมการสร้างเส้นเลือดฝอย แต่การทำให้ตัวรับมัสคารินิก M3 เงียบลงทำให้ความสามารถของ DEET ในการเพิ่มความยาวของเส้นเลือดฝอยลดลง (รูปที่ 1a, b, แถบสีดำ)
นอกจากนี้ การสร้างหลอดเลือดในหลอดทดลองและการสร้างหลอดเลือดใหม่ในร่างกายที่เกิดจาก DEET 10-8 M หรือ 10-5 M ล้วนถูกบล็อกโดย pFHHSiD (วงกลมในรูปที่ 1c, d) ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า DEET ส่งเสริมการสร้างหลอดเลือดใหม่ผ่านทางเส้นทางที่ไวต่อตัวต่อต้านตัวรับ M3 แบบเลือกหรือ siRNA ของ M3
AChE เป็นเป้าหมายระดับโมเลกุลของ DEET ยาเช่นโดเนเพซิล ซึ่งทำหน้าที่เป็นสารยับยั้ง AChE สามารถกระตุ้นการสร้างหลอดเลือดใหม่ของเซลล์ต้นกำเนิด EC ในหลอดทดลองและในแบบจำลองภาวะขาดเลือดที่ขาหลังของหนู14 เราได้ทดสอบผลของ DEET สองความเข้มข้นต่อกิจกรรมของเอนไซม์ AChE ใน HUVEC พบว่า DEET ความเข้มข้นต่ำ (10-8 M) และสูง (10-5 M) จะทำให้กิจกรรมของ AChE ของเซลล์ต้นกำเนิดลดลงเมื่อเทียบกับสภาวะควบคุม (รูปที่ 2)
DEET ทั้งสองความเข้มข้น (10-8 M และ 10-5 M) ลดกิจกรรมของอะเซทิลโคลีนเอสเทอเรสบน HUVEC BW284c51 (10-5 M) ถูกใช้เป็นตัวควบคุมสารยับยั้งอะเซทิลโคลีนเอสเทอเรส ผลลัพธ์แสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของกิจกรรมของ AChE บน HUVEC ที่ได้รับการรักษาด้วย DEET ทั้งสองความเข้มข้นเมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ที่ได้รับการรักษาด้วยตัวพา ค่าแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SEM ของการทดลองอิสระ 6 ครั้ง *p < 0.05 เมื่อเปรียบเทียบกับการควบคุม (การทดสอบเปรียบเทียบหลายครั้งของ Kruskal-Wallis และ Dunn)
ไนตริกออกไซด์ (NO) มีส่วนเกี่ยวข้องกับกระบวนการสร้างหลอดเลือด 33 ดังนั้น จึงมีการศึกษาการผลิต NO ใน HUVEC ที่กระตุ้นด้วย DEET การผลิต NO ในหลอดเลือดที่ได้รับการบำบัดด้วย DEET เพิ่มขึ้นเมื่อเทียบกับเซลล์ควบคุม แต่มีความสำคัญเฉพาะที่ขนาดยา 10-8 M เท่านั้น (รูปที่ 3c) เพื่อพิจารณาการเปลี่ยนแปลงของโมเลกุลที่ควบคุมการผลิต NO ที่เกิดจาก DEET การแสดงออกและการทำงานของ eNOS ถูกวิเคราะห์โดยการบล็อตเวสเทิร์น แม้ว่าการรักษาด้วย DEET จะไม่เปลี่ยนแปลงการแสดงออกของ eNOS แต่จะเพิ่มการฟอสโฟรีเลชันของ eNOS ที่ตำแหน่งการกระตุ้น (Ser-1177) อย่างมีนัยสำคัญ ในขณะที่ลดตำแหน่งยับยั้ง (Thr-495) เมื่อเทียบกับเซลล์ที่ไม่ได้รับการรักษาในการฟอสโฟรีเลชันของ eNOS (รูปที่ 3d) นอกจากนี้ อัตราส่วนของ eNOS ที่ถูกฟอสโฟรีเลชันที่ตำแหน่งการกระตุ้นและตำแหน่งยับยั้งถูกคำนวณหลังจากปรับปริมาณ eNOS ที่ถูกฟอสโฟรีเลชันเป็นมาตรฐานเมื่อเทียบกับปริมาณเอนไซม์ทั้งหมด อัตราส่วนนี้เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญใน HUVEC ที่ได้รับการบำบัดด้วย DEET ในความเข้มข้นต่างๆ เมื่อเทียบกับเซลล์ที่ไม่ได้รับการรักษา (รูปที่ 3d)
ในที่สุด การแสดงออกของ VEGF ซึ่งเป็นหนึ่งในปัจจัยหลักที่ก่อให้เกิดการสร้างหลอดเลือดใหม่ ได้รับการวิเคราะห์โดยการบล็อตเวสเทิร์น DEET เพิ่มการแสดงออกของ VEGF อย่างมีนัยสำคัญ ในขณะที่ pFHHSiD ปิดกั้นการแสดงออกนี้อย่างสมบูรณ์
เนื่องจากผลของ DEET ไวต่อการปิดกั้นทางเภสัชวิทยาและการลดระดับของตัวรับ M3 เราจึงทดสอบสมมติฐานที่ว่า DEET อาจช่วยเพิ่มการส่งสัญญาณของแคลเซียม ที่น่าประหลาดใจคือ DEET ไม่สามารถเพิ่มแคลเซียมในไซโทพลาสซึมใน HUVEC (ไม่มีการแสดงข้อมูล) และ HEK/M3 (รูปที่ 4a, b) สำหรับความเข้มข้นทั้งสองที่ใช้
เวลาโพสต์: 30-12-2024