ยาถ่ายพยาธิ N,N-diethyl-m-toluamide (ดีอีท) มีรายงานว่ายับยั้ง AChE (อะเซทิลโคลีนเอสเทอเรส) และมีคุณสมบัติเป็นสารก่อมะเร็งที่อาจเกิดขึ้นได้เนื่องจากการสร้างหลอดเลือดมากเกินไป ในบทความนี้ เราแสดงให้เห็นว่า DEET กระตุ้นเซลล์บุผนังหลอดเลือดโดยเฉพาะ ซึ่งส่งเสริมการสร้างหลอดเลือดใหม่ ส่งผลให้เนื้องอกเติบโตมากขึ้น DEET กระตุ้นกระบวนการของเซลล์ที่นำไปสู่การสร้างหลอดเลือดใหม่ ซึ่งรวมถึงการเพิ่มจำนวน การเคลื่อนย้าย และการยึดเกาะ ซึ่งเกี่ยวข้องกับการผลิต NO ที่เพิ่มขึ้นและการแสดงออกของ VEGF ในเซลล์บุผนังหลอดเลือด การยับยั้ง M3 หรือการใช้สารยับยั้ง M3 ทางเภสัชวิทยาช่วยขจัดผลกระทบเหล่านี้ทั้งหมด ซึ่งชี้ให้เห็นว่าการสร้างหลอดเลือดใหม่ที่เกิดจาก DEET มีความไวต่อ M3 การทดลองที่เกี่ยวข้องกับการส่งสัญญาณแคลเซียมในเซลล์บุผนังหลอดเลือดและเซลล์ HEK ที่มีการแสดงออกของตัวรับ M3 มากเกินไป รวมถึงการศึกษาการจับและการเชื่อมต่อ แสดงให้เห็นว่า DEET ทำหน้าที่เป็นตัวปรับเปลี่ยนอัลโลสเตอริกของตัวรับ M3 นอกจากนี้ DEET ยังยับยั้ง AChE ส่งผลให้เพิ่มการดูดซึมของอะเซทิลโคลีนและการจับกับตัวรับ M3 และเพิ่มผลการสร้างเส้นเลือดใหม่ผ่านการควบคุมอัลโลสเตอริก
เซลล์ EC ปฐมภูมิถูกแยกจากหลอดเลือดแดงใหญ่ของหนูสวิส วิธีการสกัดถูกดัดแปลงมาจากโปรโตคอลโคบายาชิ 26 เซลล์ EC ของหนูถูกเพาะเลี้ยงในอาหาร EBM-2 ที่เสริมด้วย FBS ที่ทำให้ไม่ทำงานด้วยความร้อน 5% จนถึงการเพาะเลี้ยงครั้งที่สี่
ผลของ DEET สองความเข้มข้นต่อการเพิ่มจำนวนเซลล์ HUVEC, U87MG หรือ BF16F10 ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ชุด CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026) โดยสรุป เซลล์ 5.103 เซลล์ต่อหลุมถูกเพาะลงในเพลต 96 หลุม ทิ้งไว้ข้ามคืน จากนั้นจึงถูกทำให้แห้งด้วย DEET เป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจากนำอาหารเลี้ยงเชื้อออกแล้ว ให้เติมสารละลายยึดสีย้อมลงในแต่ละหลุมของไมโครเพลต และบ่มเซลล์ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30 นาที ตรวจวัดระดับการเรืองแสงโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลตแบบมัลติโหมด Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, ประเทศเยอรมนี) ที่ติดตั้งฟิลเตอร์กระตุ้น 485 นาโนเมตร และฟิลเตอร์ปล่อยแสง 530 นาโนเมตร
เพาะ HUVEC ในจานเพาะเลี้ยง 96 หลุม โดยมีความหนาแน่น 104 เซลล์ต่อหลุม เซลล์ถูกบำบัดด้วย DEET เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ประเมินความมีชีวิตของเซลล์โดยใช้วิธีทดสอบ MTT แบบวัดสี (Sigma-Aldrich, M5655) ค่าความหนาแน่นเชิงแสงได้จากเครื่องอ่านไมโครเพลตแบบมัลติโหมด (Mithras LB940) ที่ความยาวคลื่น 570 นาโนเมตร
ศึกษาผลของ DEET โดยใช้การทดสอบการสร้างหลอดเลือดใหม่ในหลอดทดลอง การรักษาด้วย DEET ความเข้มข้น 10-8 M หรือ 10-5 M ช่วยเพิ่มการสร้างเส้นเลือดฝอยใน HUVEC (รูปที่ 1a, b, แถบสีขาว) เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม การรักษาด้วย DEET ความเข้มข้นตั้งแต่ 10-14 ถึง 10-5 M พบว่าความยาวของเส้นเลือดฝอยคงที่ที่ DEET ความเข้มข้น 10-8 M (ภาพเสริม S2) ไม่พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในผลการสร้างเส้นเลือดฝอยในหลอดทดลองของ HUVEC ที่ได้รับ DEET ในช่วงความเข้มข้น 10-8 M และ 10-5 M
เพื่อศึกษาผลของ DEET ต่อการสร้างหลอดเลือดใหม่ เราได้ทำการศึกษาการสร้างหลอดเลือดใหม่ในร่างกาย หลังจาก 14 วัน หนูที่ได้รับการฉีดเซลล์เยื่อบุผนังหลอดเลือดที่เพาะเลี้ยงด้วย DEET ระดับ 10-8 M หรือ 10-5 M พบว่าปริมาณฮีโมโกลบินเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 1c แถบสีขาว)
นอกจากนี้ ยังศึกษาการสร้างหลอดเลือดใหม่ที่เกิดจาก DEET ในหนูทดลองที่มีเซลล์ U87MG ซึ่งได้รับการฉีด DEET ทุกวัน (ip) ในขนาดที่ทราบว่าสามารถกระตุ้นความเข้มข้นในพลาสมา 10-5 M ซึ่งถือว่าปกติในมนุษย์ที่ได้รับ DEET ในการศึกษา 23 พบว่าเนื้องอกที่ตรวจพบได้ (เช่น เนื้องอกที่มีขนาดมากกว่า 100 มม.3) เกิดขึ้น 14 วันหลังจากการฉีดเซลล์ U87MG เข้าไปในหนูทดลอง ในวันที่ 28 การเจริญเติบโตของเนื้องอกเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในหนูทดลองที่ได้รับ DEET เมื่อเทียบกับหนูทดลองกลุ่มควบคุม (รูปที่ 1d, สี่เหลี่ยม) นอกจากนี้ การย้อมสี CD31 ของเนื้องอกยังแสดงให้เห็นว่า DEET เพิ่มพื้นที่หลอดเลือดฝอยอย่างมีนัยสำคัญ แต่ไม่เพิ่มความหนาแน่นของหลอดเลือดฝอย (รูปที่ 1e-g)
เพื่อศึกษาบทบาทของตัวรับมัสคารินิกในการเพิ่มจำนวนเซลล์ที่ถูกเหนี่ยวนำโดย DETA ได้ใช้ DETA ความเข้มข้น 10-8 โมลาร์ หรือ 10-5 โมลาร์ ร่วมกับ pFHHSiD (10-7 โมลาร์ ซึ่งเป็นตัวต้านตัวรับ M3 แบบจำเพาะ) ในการรักษา HUVEC พบว่า pFHHSiD ยับยั้งคุณสมบัติการเพิ่มจำนวนของ DETA ได้อย่างสมบูรณ์ในทุกความเข้มข้น (ตารางที่ 1)
ภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ เรายังศึกษาว่า DEET จะเพิ่มความยาวของเส้นเลือดฝอยในเซลล์ HUVEC หรือไม่ ในทำนองเดียวกัน pFHHSiD สามารถป้องกันความยาวของเส้นเลือดฝอยที่เกิดจาก DEET ได้อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 1a, b, แถบสีเทา) นอกจากนี้ ยังมีการทดลองที่คล้ายกันกับ M3 siRNA แม้ว่า siRNA ควบคุมจะไม่มีประสิทธิภาพในการส่งเสริมการสร้างเส้นเลือดฝอย แต่การยับยั้งตัวรับมัสคารินิก M3 ทำให้ความสามารถของ DEET ในการเพิ่มความยาวของเส้นเลือดฝอยลดลง (รูปที่ 1a, b, แถบสีดำ)
นอกจากนี้ การสร้างหลอดเลือดในหลอดทดลองและการสร้างหลอดเลือดใหม่ในร่างกายที่เกิดจาก DEET 10-8 โมลาร์ หรือ 10-5 โมลาร์ ถูกปิดกั้นอย่างสมบูรณ์โดย pFHHSiD (รูปที่ 1c, d, วงกลม) ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า DEET ส่งเสริมการสร้างหลอดเลือดใหม่ผ่านวิถีที่ไวต่อตัวต้านตัวรับ M3 แบบจำเพาะหรือ M3 siRNA
AChE เป็นเป้าหมายระดับโมเลกุลของ DEET ยาเช่นโดเนเพซิล ซึ่งทำหน้าที่เป็นสารยับยั้ง AChE สามารถกระตุ้นการสร้างหลอดเลือดใหม่ของเซลล์ต้นกำเนิด (EC) ได้ทั้งในหลอดทดลองและในหนูทดลองที่ขาดเลือดที่ขาหลัง14 เราได้ทดสอบผลของ DEET สองความเข้มข้นต่อกิจกรรมของเอนไซม์ AChE ใน HUVEC พบว่า DEET ความเข้มข้นต่ำ (10-8 โมลาร์) และสูง (10-5 โมลาร์) ลดกิจกรรมของ AChE ในเยื่อบุผนังหลอดเลือดเมื่อเทียบกับสภาวะควบคุม (รูปที่ 2)
DEET ความเข้มข้นทั้งสอง (10-8 โมลาร์ และ 10-5 โมลาร์) ลดกิจกรรมของเอนไซม์อะเซทิลโคลีนเอสเทอเรสบน HUVEC BW284c51 (10-5 โมลาร์) ถูกใช้เป็นตัวควบคุมสำหรับสารยับยั้งเอนไซม์อะเซทิลโคลีนเอสเทอเรส ผลลัพธ์แสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของกิจกรรมของเอนไซม์อะเซทิลโคลีนเอสเทอเรสบน HUVEC ที่ได้รับ DEET ความเข้มข้นทั้งสอง เมื่อเทียบกับเซลล์ที่ได้รับสารตัวพา ค่าแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SEM ของการทดลองอิสระหกครั้ง *p < 0.05 เทียบกับการทดลองควบคุม (การทดสอบเปรียบเทียบหลายรายการของ Kruskal-Wallis และ Dunn)
ไนตริกออกไซด์ (NO) มีส่วนเกี่ยวข้องกับกระบวนการสร้างหลอดเลือด 33 ดังนั้นจึงมีการศึกษาการผลิต NO ใน HUVEC ที่ถูกกระตุ้นด้วย DEET การผลิต NO ในเซลล์บุผนังหลอดเลือดที่ได้รับ DEET เพิ่มขึ้นเมื่อเทียบกับเซลล์ควบคุม แต่มีความสำคัญเฉพาะที่ขนาดยา 10-8 โมลาร์ (รูปที่ 3c) เพื่อศึกษาการเปลี่ยนแปลงทางโมเลกุลที่ควบคุมการผลิต NO ที่เกิดจาก DEET ได้มีการวิเคราะห์การแสดงออกและการกระตุ้นของ eNOS โดยการบล็อตเวสเทิร์น แม้ว่าการรักษาด้วย DEET จะไม่เปลี่ยนแปลงการแสดงออกของ eNOS แต่การเพิ่มการฟอสโฟรีเลชันของ eNOS ที่บริเวณกระตุ้น (Ser-1177) อย่างมีนัยสำคัญ ในขณะที่ลดตำแหน่งยับยั้ง (Thr-495) เมื่อเทียบกับเซลล์ที่ไม่ได้รับ DEET ในการฟอสโฟรีเลชันของ eNOS (รูปที่ 3d) นอกจากนี้ อัตราส่วนของ eNOS ที่ถูกฟอสโฟรีเลชันที่บริเวณกระตุ้นและบริเวณยับยั้งยังถูกคำนวณหลังจากปรับปริมาณ eNOS ที่ถูกฟอสโฟรีเลชันให้อยู่ในระดับปกติเทียบกับปริมาณเอนไซม์ทั้งหมด อัตราส่วนนี้เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญใน HUVEC ที่ได้รับการบำบัดด้วย DEET ในความเข้มข้นต่างๆ เมื่อเทียบกับเซลล์ที่ไม่ได้รับการรักษา (รูปที่ 3d)
ในที่สุด การแสดงออกของ VEGF ซึ่งเป็นหนึ่งในปัจจัยหลักที่ก่อให้เกิดการสร้างเส้นเลือดใหม่ ได้รับการวิเคราะห์โดยการบล็อตเวสเทิร์น พบว่า DEET เพิ่มการแสดงออกของ VEGF อย่างมีนัยสำคัญ ในขณะที่ pFHHSiD ยับยั้งการแสดงออกของ VEGF ได้อย่างสมบูรณ์
เนื่องจากผลของ DEET ไวต่อการยับยั้งทางเภสัชวิทยาและการลดระดับของตัวรับ M3 เราจึงทดสอบสมมติฐานที่ว่า DEET อาจช่วยเพิ่มการส่งสัญญาณแคลเซียม ที่น่าประหลาดใจคือ DEET ไม่สามารถเพิ่มแคลเซียมในไซโทพลาสซึมใน HUVEC (ไม่ได้แสดงข้อมูล) และ HEK/M3 (รูปที่ 4a, b) สำหรับความเข้มข้นทั้งสองที่ใช้
เวลาโพสต์: 30 ธันวาคม 2567