ยาถ่ายพยาธิ N,N-diethyl-m-toluamide (ดีอีทีมีรายงานว่า DEET ยับยั้ง AChE (acetylcholinesterase) และอาจมีคุณสมบัติก่อมะเร็งเนื่องจากการสร้างหลอดเลือดมากเกินไป ในบทความนี้ เราแสดงให้เห็นว่า DEET กระตุ้นเซลล์เยื่อบุหลอดเลือดโดยเฉพาะ ซึ่งส่งเสริมการสร้างหลอดเลือดใหม่ จึงทำให้การเจริญเติบโตของเนื้องอกเพิ่มขึ้น DEET กระตุ้นกระบวนการระดับเซลล์ที่นำไปสู่การสร้างหลอดเลือดใหม่ รวมถึงการเพิ่มจำนวน การเคลื่อนย้าย และการยึดเกาะ ซึ่งเกี่ยวข้องกับการเพิ่มขึ้นของการผลิต NO และการแสดงออกของ VEGF ในเซลล์เยื่อบุหลอดเลือด การปิดกั้น M3 หรือการใช้สารยับยั้ง M3 ทางเภสัชวิทยาทำให้ผลกระทบเหล่านี้หายไปทั้งหมด ซึ่งบ่งชี้ว่าการสร้างหลอดเลือดใหม่ที่เกิดจาก DEET นั้นไวต่อ M3 การทดลองที่เกี่ยวข้องกับการส่งสัญญาณแคลเซียมในเซลล์เยื่อบุหลอดเลือดและเซลล์ HEK ที่มีการแสดงออกของตัวรับ M3 มากเกินไป รวมถึงการศึกษาการจับและการเชื่อมต่อ แสดงให้เห็นว่า DEET ทำหน้าที่เป็นตัวปรับอัลโลสเตอริกของตัวรับ M3 นอกจากนี้ DEET ยังยับยั้ง AChE ส่งผลให้การดูดซึมอะเซทิลโคลีนและการจับกับตัวรับ M3 เพิ่มขึ้น และเสริมฤทธิ์ในการกระตุ้นการสร้างหลอดเลือดใหม่ผ่านการควบคุมแบบอัลโลสเตอริก
เซลล์บุผนังหลอดเลือดหลัก (ECs) ถูกแยกออกจากหลอดเลือดแดงใหญ่ของหนูสวิส วิธีการสกัดดัดแปลงมาจากโปรโตคอล Kobayashi 26 เซลล์บุผนังหลอดเลือดของหนูถูกเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ EBM-2 ที่เสริมด้วย FBS ที่ผ่านการให้ความร้อนเพื่อยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ 5% จนถึงรอบที่สี่
วิเคราะห์ผลของ DEET สองความเข้มข้นต่อการเพิ่มจำนวนของเซลล์ HUVEC, U87MG หรือ BF16F10 โดยใช้ชุดทดสอบ CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026) โดยสังเขป เพาะเซลล์ 5 x 10³ เซลล์ต่อหลุมในจานเพาะเลี้ยง 96 หลุม ปล่อยให้เซลล์เกาะติดข้ามคืน แล้วจึงให้เซลล์สัมผัสกับ DEET เป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจากนำอาหารเลี้ยงเซลล์ออกแล้ว เติมสารละลายที่ใช้ในการจับกับสีย้อมลงในแต่ละหลุมของไมโครเพลท และบ่มเซลล์ที่อุณหภูมิ 37 °C เป็นเวลา 30 นาที วัดระดับฟลูออเรสเซนซ์โดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลทแบบมัลติโหมด Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany) ที่ติดตั้งตัวกรองการกระตุ้นที่ 485 nm และตัวกรองการปล่อยแสงที่ 530 nm
เซลล์ HUVEC ถูกเพาะเลี้ยงในจานเพาะเลี้ยง 96 หลุม ที่ความหนาแน่น 104 เซลล์ต่อหลุม เซลล์ได้รับการบำบัดด้วย DEET เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ความสามารถในการอยู่รอดของเซลล์ได้รับการประเมินโดยใช้การทดสอบ MTT แบบวัดสี (Sigma-Aldrich, M5655) ค่าความหนาแน่นเชิงแสงได้จากเครื่องอ่านไมโครเพลทแบบมัลติโหมด (Mithras LB940) ที่ความยาวคลื่น 570 นาโนเมตร
ศึกษาผลของ DEET โดยใช้การทดสอบการสร้างหลอดเลือดใหม่ในหลอดทดลอง การรักษาด้วย DEET ที่ความเข้มข้น 10⁻⁸ M หรือ 10⁻⁵ M เพิ่มความยาวของหลอดเลือดฝอยใน HUVEC (รูปที่ 1a, b แท่งสีขาว) เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม การรักษาด้วย DEET ที่ความเข้มข้นตั้งแต่ 10⁻¹⁴ ถึง 10⁻⁵ M แสดงให้เห็นว่าความยาวของหลอดเลือดฝอยถึงจุดคงที่ที่ความเข้มข้น 10⁻⁸ M ของ DEET (รูปเพิ่มเติม S2) ไม่พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในผลการกระตุ้นการสร้างหลอดเลือดใหม่ในหลอดทดลองของ HUVEC ที่ได้รับการรักษาด้วย DEET ในช่วงความเข้มข้น 10⁻⁸ M และ 10⁻⁵ M
เพื่อตรวจสอบผลของ DEET ต่อการสร้างหลอดเลือดใหม่ เราได้ทำการศึกษาการสร้างหลอดเลือดใหม่ในร่างกายสัตว์ทดลอง หลังจาก 14 วัน หนูที่ฉีดเซลล์เยื่อบุหลอดเลือดที่เพาะเลี้ยงไว้ล่วงหน้าด้วย DEET ความเข้มข้น 10⁻⁸ M หรือ 10⁻⁵ M แสดงให้เห็นว่าปริมาณฮีโมโกลบินเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 1c แถบสีขาว)
นอกจากนี้ ยังมีการศึกษาการสร้างหลอดเลือดใหม่ที่เกิดจาก DEET ในหนูทดลองที่ปลูกถ่ายเซลล์ U87MG โดยฉีด DEET เข้าทางช่องท้องทุกวัน (ip) ในปริมาณที่ทราบกันว่าทำให้ความเข้มข้นในพลาสมาอยู่ที่ 10-5 M ซึ่งเป็นระดับปกติในมนุษย์ที่ได้รับสารนี้ ตรวจพบเนื้องอกที่สังเกตได้ (เช่น เนื้องอกขนาด >100 mm3) 14 วันหลังจากฉีดเซลล์ U87MG เข้าไปในหนูทดลอง ในวันที่ 28 การเจริญเติบโตของเนื้องอกเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในหนูทดลองที่ได้รับการรักษาด้วย DEET เมื่อเทียบกับหนูทดลองกลุ่มควบคุม (รูปที่ 1d, สี่เหลี่ยม) ยิ่งไปกว่านั้น การย้อมสี CD31 ของเนื้องอกแสดงให้เห็นว่า DEET เพิ่มพื้นที่ของเส้นเลือดฝอยอย่างมีนัยสำคัญ แต่ไม่เพิ่มความหนาแน่นของหลอดเลือดขนาดเล็ก (รูปที่ 1e–g)
เพื่อตรวจสอบบทบาทของตัวรับมัสคารินิกในการเพิ่มจำนวนเซลล์ที่เกิดจาก DETA จึงใช้ DETA ที่ความเข้มข้น 10⁻⁸ M หรือ 10⁻⁵ M ร่วมกับ pFHHSiD (10⁻⁷ M ซึ่งเป็นสารต้านตัวรับ M3 ที่เลือกจำเพาะ) ในการทดลองกับเซลล์ HUVEC พบว่า pFHHSiD สามารถยับยั้งคุณสมบัติการเพิ่มจำนวนเซลล์ของ DETA ได้อย่างสมบูรณ์ในทุกความเข้มข้น (ตารางที่ 1)
ภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ เรายังได้ตรวจสอบว่า DEET จะเพิ่มความยาวของเส้นเลือดฝอยในเซลล์ HUVEC หรือไม่ ในทำนองเดียวกัน pFHHSiD สามารถยับยั้งการเพิ่มความยาวของเส้นเลือดฝอยที่เกิดจาก DEET ได้อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 1a, b แถบสีเทา) นอกจากนี้ ยังมีการทดลองที่คล้ายกันโดยใช้ M3 siRNA แม้ว่า siRNA ควบคุมจะไม่มีประสิทธิภาพในการส่งเสริมการสร้างเส้นเลือดฝอย แต่การยับยั้งตัวรับมัสคารินิก M3 ก็ทำให้ความสามารถของ DEET ในการเพิ่มความยาวของเส้นเลือดฝอยหายไป (รูปที่ 1a, b แถบสีดำ)
นอกจากนี้ การสร้างหลอดเลือดในหลอดทดลองที่เกิดจาก DEET ที่ความเข้มข้น 10-8 M หรือ 10-5 M และการสร้างหลอดเลือดใหม่ในร่างกายถูกยับยั้งอย่างสมบูรณ์โดย pFHHSiD (รูปที่ 1c, d วงกลม) ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า DEET ส่งเสริมการสร้างหลอดเลือดใหม่ผ่านทางเส้นทางที่ไวต่อสารต้านตัวรับ M3 หรือ M3 siRNA ที่เลือกจำเพาะ
AChE เป็นเป้าหมายระดับโมเลกุลของ DEET ยาเช่นโดเนเพซิลซึ่งทำหน้าที่เป็นสารยับยั้ง AChE สามารถกระตุ้นการสร้างหลอดเลือดใหม่ของเซลล์บุผนังหลอดเลือดในหลอดทดลองและในแบบจำลองภาวะขาดเลือดที่ขาหลังของหนูได้14 เราได้ทดสอบผลของ DEET สองความเข้มข้นต่อกิจกรรมของเอนไซม์ AChE ใน HUVEC ความเข้มข้นต่ำ (10-8 M) และสูง (10-5 M) ของ DEET ลดกิจกรรมของ AChE ในเซลล์บุผนังหลอดเลือดเมื่อเทียบกับสภาวะควบคุม (รูปที่ 2)
สาร DEET ทั้งสองความเข้มข้น (10⁻⁸ M และ 10⁻⁵ M) ลดกิจกรรมของเอนไซม์อะเซทิลโคลีนเอสเทอเรสในเซลล์ HUVEC BW284c51 (10⁻⁵ M) ถูกใช้เป็นสารควบคุมสำหรับสารยับยั้งอะเซทิลโคลีนเอสเทอเรส ผลลัพธ์แสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของกิจกรรม AChE ในเซลล์ HUVEC ที่ได้รับการรักษาด้วยสาร DEET ทั้งสองความเข้มข้น เมื่อเทียบกับเซลล์ที่ได้รับการรักษาด้วยสารควบคุม ค่าที่แสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SEM) จากการทดลองอิสระ 6 ครั้ง *p < 0.05 เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (การทดสอบ Kruskal-Wallis และการทดสอบเปรียบเทียบหลายกลุ่ม Dunn)
ไนตริกออกไซด์ (NO) มีส่วนเกี่ยวข้องในกระบวนการสร้างหลอดเลือดใหม่ 33 ดังนั้นจึงมีการศึกษาการผลิต NO ใน HUVEC ที่ถูกกระตุ้นด้วย DEET การผลิต NO ของเซลล์บุผนังหลอดเลือดที่ได้รับการรักษาด้วย DEET เพิ่มขึ้นเมื่อเทียบกับเซลล์ควบคุม แต่มีนัยสำคัญทางสถิติเฉพาะที่ขนาด 10-8 M เท่านั้น (รูปที่ 3c) เพื่อตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงระดับโมเลกุลที่ควบคุมการผลิต NO ที่เกิดจาก DEET จึงได้วิเคราะห์การแสดงออกและการกระตุ้นของ eNOS โดยใช้ Western blotting แม้ว่าการรักษาด้วย DEET จะไม่เปลี่ยนแปลงการแสดงออกของ eNOS แต่ก็เพิ่มการฟอสโฟรีเลชันของ eNOS ที่ตำแหน่งกระตุ้น (Ser-1177) อย่างมีนัยสำคัญ ในขณะที่ลดตำแหน่งยับยั้ง (Thr-495) เมื่อเทียบกับเซลล์ที่ไม่ได้รับการรักษาในการฟอสโฟรีเลชันของ eNOS (รูปที่ 3d) นอกจากนี้ ยังได้คำนวณอัตราส่วนของ eNOS ที่ถูกฟอสโฟรีเลชันที่ตำแหน่งกระตุ้นและตำแหน่งยับยั้งหลังจากปรับค่าปริมาณของ eNOS ที่ถูกฟอสโฟรีเลชันให้เป็นมาตรฐานตามปริมาณเอนไซม์ทั้งหมด อัตราส่วนนี้เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ HUVEC ที่ได้รับการรักษาด้วย DEET ในแต่ละความเข้มข้น เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ที่ไม่ได้รับการรักษา (รูปที่ 3d)
สุดท้ายนี้ ได้ทำการวิเคราะห์การแสดงออกของ VEGF ซึ่งเป็นหนึ่งในปัจจัยกระตุ้นการสร้างหลอดเลือดใหม่ที่สำคัญ โดยใช้เทคนิค Western blotting พบว่า DEET เพิ่มการแสดงออกของ VEGF อย่างมีนัยสำคัญ ในขณะที่ pFHHSiD ยับยั้งการแสดงออกนี้ได้อย่างสมบูรณ์
เนื่องจากผลของ DEET มีความไวต่อทั้งการปิดกั้นทางเภสัชวิทยาและการลดระดับตัวรับ M3 เราจึงทดสอบสมมติฐานที่ว่า DEET อาจช่วยเพิ่มการส่งสัญญาณแคลเซียม แต่ที่น่าประหลาดใจคือ DEET ไม่สามารถเพิ่มแคลเซียมในไซโตพลาสซึมใน HUVEC (ข้อมูลไม่ได้แสดงไว้) และ HEK/M3 (รูปที่ 4a, b) สำหรับความเข้มข้นทั้งสองที่ใช้
วันที่เผยแพร่: 30 ธันวาคม 2024