ไบโอเซนเซอร์จิบเบอเรลลินเชิงปริมาณเผยให้เห็นบทบาทของจิบเบอเรลลินในการกำหนดปล้องในเนื้อเยื่อเจริญปลายยอด

การเจริญเติบโตของเนื้อเยื่อเจริญปลายยอด (SAM) มีความสำคัญอย่างยิ่งต่อโครงสร้างของลำต้น ฮอร์โมนพืชจิบเบอเรลลิน(GA) มีบทบาทสำคัญในการประสานการเจริญเติบโตของพืช แต่บทบาทของพวกมันใน SAM ยังคงไม่เป็นที่เข้าใจอย่างถ่องแท้ เราจึงได้พัฒนาไบโอเซนเซอร์แบบอัตราส่วนของการส่งสัญญาณ GA โดยการออกแบบโปรตีน DELLA เพื่อยับยั้งหน้าที่ควบคุมที่สำคัญในการตอบสนองการถอดรหัสของ GA ขณะเดียวกันก็รักษาการย่อยสลายไว้เมื่อ GA รับรู้ เราแสดงให้เห็นว่าไบโอเซนเซอร์ที่อาศัยการย่อยสลายนี้สามารถบันทึกการเปลี่ยนแปลงของระดับ GA และการตรวจจับของเซลล์ในระหว่างการพัฒนาได้อย่างแม่นยำ เราใช้ไบโอเซนเซอร์นี้เพื่อทำแผนที่กิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ใน SAM เราแสดงให้เห็นว่าสัญญาณ GA สูงส่วนใหญ่พบในเซลล์ที่อยู่ระหว่างออร์แกนไพรมอร์เดีย ซึ่งเป็นเซลล์ตั้งต้นของเซลล์ปล้อง เราใช้วิธีการหาค่าเพิ่มและค่าสูญเสียฟังก์ชัน เรายังแสดงให้เห็นเพิ่มเติมว่า GA ควบคุมการวางแนวของระนาบการแบ่งเซลล์ สร้างโครงสร้างของเซลล์ปล้องแบบมาตรฐาน ซึ่งส่งเสริมการกำหนดตำแหน่งของปล้องใน SAM
เนื้อเยื่อเจริญปลายยอด (SAM) ซึ่งอยู่ที่ปลายยอด ประกอบด้วยช่องว่างของเซลล์ต้นกำเนิด ซึ่งกิจกรรมของเซลล์เหล่านี้จะสร้างอวัยวะด้านข้างและข้อลำต้นในลักษณะโมดูลาร์และวนซ้ำตลอดอายุของพืช หน่วยซ้ำเหล่านี้หรือที่เรียกว่าข้อพืช ประกอบด้วยปล้องและอวัยวะด้านข้างที่ข้อ และเนื้อเยื่อเจริญรักแร้ในซอกใบ1 การเจริญเติบโตและการจัดเรียงตัวของข้อพืชจะเปลี่ยนแปลงไปในระหว่างการพัฒนา ในพืชสกุล Arabidopsis การเจริญเติบโตของปล้องจะถูกระงับในระยะการเจริญเติบโต และเนื้อเยื่อเจริญรักแร้จะพักตัวอยู่ในซอกใบกุหลาบ ในช่วงการเปลี่ยนผ่านสู่ระยะออกดอก SAM จะกลายเป็นเนื้อเยื่อเจริญช่อดอก ก่อให้เกิดปล้องและตาข้างที่ยาวขึ้น กิ่งเล็กๆ ในซอกใบ และต่อมาคือดอกไร้ใบ2 แม้ว่าเราจะมีความก้าวหน้าอย่างมากในการทำความเข้าใจกลไกที่ควบคุมการเริ่มต้นของใบ ดอก และกิ่งก้าน แต่เรามีความรู้ค่อนข้างน้อยว่าปล้องเกิดขึ้นได้อย่างไร
การทำความเข้าใจการกระจายตัวของ GA ทั้งในเชิงปริภูมิและเวลาจะช่วยให้เข้าใจหน้าที่ของฮอร์โมนเหล่านี้ในเนื้อเยื่อต่างๆ และในระยะพัฒนาการต่างๆ ได้ดียิ่งขึ้น การแสดงภาพการสลายตัวของการรวมตัวของ RGA-GFP ที่แสดงออกภายใต้การทำงานของโปรโมเตอร์ของมันเอง ให้ข้อมูลสำคัญเกี่ยวกับการควบคุมระดับ GA ทั้งหมดในราก15,16 อย่างไรก็ตาม การแสดงออกของ RGA แตกต่างกันไปในแต่ละเนื้อเยื่อ17 และถูกควบคุมโดย GA18 ดังนั้น การแสดงออกที่แตกต่างกันของโปรโมเตอร์ RGA อาจส่งผลให้เกิดรูปแบบการเรืองแสงที่สังเกตได้จาก RGA-GFP ดังนั้นวิธีนี้จึงไม่ใช่เชิงปริมาณ เมื่อเร็ว ๆ นี้ GA19,20 ซึ่งติดฉลากด้วยฟลูออเรสซีน (Fl) ที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพ เผยให้เห็นการสะสมของ GA ในเอนโดคอร์เทกซ์รากและการควบคุมระดับเซลล์โดยการขนส่ง GA เมื่อไม่นานนี้ เซ็นเซอร์ GA FRET nlsGPS1 แสดงให้เห็นว่าระดับ GA มีความสัมพันธ์กับการยืดตัวของเซลล์ในราก เส้นใย และไฮโปโคทิลที่เติบโตในที่มืด21 อย่างไรก็ตาม ดังที่เราได้เห็น ความเข้มข้นของ GA ไม่ใช่พารามิเตอร์เดียวที่ควบคุมกิจกรรมการส่งสัญญาณของ GA เนื่องจากขึ้นอยู่กับกระบวนการตรวจจับที่ซับซ้อน ในที่นี้ จากความเข้าใจของเราเกี่ยวกับวิถีการส่งสัญญาณของ DELLA และ GA เราได้รายงานการพัฒนาและลักษณะเฉพาะของไบโอเซนเซอร์แบบอัตราส่วนที่อาศัยการย่อยสลายสำหรับการส่งสัญญาณของ GA ในการพัฒนาไบโอเซนเซอร์เชิงปริมาณนี้ เราใช้ RGA ที่ไวต่อ GA กลายพันธุ์ ซึ่งหลอมรวมกับโปรตีนเรืองแสงและมีการแสดงออกอย่างแพร่หลายในเนื้อเยื่อ รวมถึงโปรตีนเรืองแสงที่ไม่ไวต่อ GA เราแสดงให้เห็นว่าการหลอมรวมของโปรตีน RGA กลายพันธุ์ไม่รบกวนการส่งสัญญาณ GA ภายในเมื่อมีการแสดงออกอย่างแพร่หลาย และไบโอเซนเซอร์นี้สามารถวัดปริมาณกิจกรรมการส่งสัญญาณที่เกิดจากทั้งอินพุต GA และการประมวลผลสัญญาณ GA โดยอุปกรณ์ตรวจจับด้วยความละเอียดเชิงพื้นที่และเวลาสูง เราใช้ไบโอเซนเซอร์นี้เพื่อทำแผนที่การกระจายตัวของกิจกรรมการส่งสัญญาณของ GA ทั้งในเชิงปริภูมิและเวลา และวัดปริมาณว่า GA ควบคุมพฤติกรรมของเซลล์ในชั้นหนังกำพร้า SAM อย่างไร เราแสดงให้เห็นว่า GA ควบคุมทิศทางของระนาบการแบ่งตัวของเซลล์ SAM ซึ่งอยู่ระหว่างออร์แกนไพรมอร์เดีย จึงกำหนดโครงสร้างของเซลล์ตามแบบแผนของปล้อง
สุดท้าย เราได้ตั้งคำถามว่า qmRGA สามารถรายงานการเปลี่ยนแปลงของระดับ GA ภายในเซลล์โดยใช้ไฮโปโคทิลที่กำลังเจริญเติบโตได้หรือไม่ ก่อนหน้านี้เราได้แสดงให้เห็นว่าไนเตรตกระตุ้นการเจริญเติบโตโดยการเพิ่มการสังเคราะห์ GA และในทางกลับกันก็เพิ่มการย่อยสลาย DELLA34 ด้วย ดังนั้น เราจึงพบว่าความยาวของไฮโปโคทิลในต้นกล้า pUBQ10::qmRGA ที่ปลูกภายใต้ปริมาณไนเตรตที่มาก (NO3− 10 มิลลิโมลาร์) มีความยาวมากกว่าต้นกล้าที่ปลูกภายใต้สภาวะที่ขาดไนเตรตอย่างมีนัยสำคัญ (ภาพเสริม 6a) สอดคล้องกับการตอบสนองการเจริญเติบโต สัญญาณ GA สูงกว่าในไฮโปโคทิลของต้นกล้าที่ปลูกภายใต้สภาวะ NO3− 10 มิลลิโมลาร์ เมื่อเทียบกับต้นกล้าที่ปลูกในสภาวะที่ไม่มีไนเตรต (ภาพเสริม 6b, c) ดังนั้น qmRGA ยังช่วยให้สามารถติดตามการเปลี่ยนแปลงของสัญญาณ GA ที่เกิดจากการเปลี่ยนแปลงความเข้มข้นของ GA ภายในเซลล์ได้อีกด้วย
เพื่อทำความเข้าใจว่ากิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ที่ตรวจพบโดย qmRGA ขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของ GA และการรับรู้ GA ตามที่คาดการณ์ไว้ตามการออกแบบเซ็นเซอร์หรือไม่ เราจึงวิเคราะห์การแสดงออกของตัวรับ GID1 ทั้งสามตัวในเนื้อเยื่อพืชและเนื้อเยื่อสืบพันธุ์ ในต้นกล้า สายพันธุ์รายงาน GID1-GUS แสดงให้เห็นว่า GID1a และ c มีการแสดงออกสูงในใบเลี้ยง (รูปที่ 3a-c) นอกจากนี้ ตัวรับทั้งสามตัวยังแสดงออกในใบ รากต้นอ่อนด้านข้าง ปลายราก (ยกเว้นหมวกรากของ GID1b) และระบบท่อลำเลียง (รูปที่ 3a-c) ใน SAM ของช่อดอก เราตรวจพบสัญญาณ GUS เฉพาะ GID1b และ 1c (รูปที่ 7a-c เสริม) การผสมพันธุ์แบบ in situ hybridization ยืนยันรูปแบบการแสดงออกเหล่านี้ และแสดงให้เห็นเพิ่มเติมว่า GID1c มีการแสดงออกอย่างสม่ำเสมอในระดับต่ำใน SAM ในขณะที่ GID1b มีการแสดงออกสูงกว่าที่ขอบของ SAM (รูปที่ 7d-l เสริม) การเชื่อมประสานการแปล pGID1b::2xmTQ2-GID1b ยังเผยให้เห็นช่วงการแสดงออกของ GID1b ที่ไล่ระดับ ตั้งแต่การแสดงออกต่ำหรือไม่มีเลยที่บริเวณกึ่งกลางของ SAM ไปจนถึงการแสดงออกสูงที่ขอบอวัยวะ (ภาพเสริม 7m) ดังนั้น ตัวรับ GID1 จึงไม่กระจายตัวอย่างสม่ำเสมอทั่วทั้งและภายในเนื้อเยื่อ ในการทดลองต่อมา เรายังพบว่าการแสดงออกที่มากเกินไปของ GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) เพิ่มความไวของ qmRGA ในไฮโปโคทิลต่อการใช้ GA ภายนอก (รูปที่ 3d, e) ในทางตรงกันข้าม การเรืองแสงที่วัดโดย qd17mRGA ในไฮโปโคทิลไม่ไวต่อการใช้ GA3 (รูปที่ 3f, g) สำหรับการทดสอบทั้งสองแบบ ต้นกล้าได้รับ GA ความเข้มข้นสูง (GA3 100 ไมโครโมลาร์) เพื่อประเมินพฤติกรรมที่รวดเร็วของเซ็นเซอร์ ซึ่งความสามารถในการจับกับตัวรับ GID1 จะเพิ่มขึ้นหรือลดลง ผลลัพธ์เหล่านี้เมื่อนำมารวมกันยืนยันว่าไบโอเซนเซอร์ qmRGA ทำหน้าที่ร่วมกันเป็นเซนเซอร์ GA และ GA และชี้ให้เห็นว่าการแสดงออกที่แตกต่างกันของตัวรับ GID1 สามารถปรับเปลี่ยนการแผ่รังสีของเซนเซอร์ได้อย่างมีนัยสำคัญ
จนถึงปัจจุบัน การกระจายตัวของสัญญาณ GA ในเซลล์ต้นกำเนิด SAM ยังคงไม่ชัดเจน ดังนั้นเราจึงใช้พืชที่แสดงออก qmRGA และ pCLV3::mCherry-NLS stem cell reporter35 เพื่อคำนวณแผนที่เชิงปริมาณความละเอียดสูงของกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA โดยมุ่งเน้นไปที่ชั้น L1 (ชั้นหนังกำพร้า; รูปที่ 4a, b, ดูวิธีการและวิธีการเสริม) เนื่องจาก L1 มีบทบาทสำคัญในการควบคุมการเติบโตของ SAM36 ในที่นี้ การแสดงออกของ pCLV3::mCherry-NLS เป็นจุดอ้างอิงทางเรขาคณิตคงที่สำหรับการวิเคราะห์การกระจายตัวของกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ทั้งในเชิงปริภูมิและเวลา37 แม้ว่า GA จะถือว่าจำเป็นต่อการพัฒนาอวัยวะด้านข้าง4 แต่เราพบว่าสัญญาณ GA อยู่ในระดับต่ำในปริภูมิต้นอ่อนของดอกไม้ (P) ตั้งแต่ระยะ P3 (รูปที่ 4a, b) ในขณะที่ปริภูมิต้นอ่อน P1 และ P2 มีกิจกรรมปานกลางใกล้เคียงกับในส่วนกลาง (รูปที่ 4a, b) ตรวจพบกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ที่สูงขึ้นที่ขอบเขตของอวัยวะปฐมภูมิ โดยเริ่มต้นที่ P1/P2 (ที่ด้านข้างของขอบเขต) และสูงสุดที่ P4 รวมถึงในเซลล์ทั้งหมดของบริเวณรอบนอกที่อยู่ระหว่างปฐมภูมิ (รูปที่ 4a, b และรูปเสริม 8a, b) กิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ที่สูงขึ้นนี้พบไม่เพียงแต่ในชั้นหนังกำพร้าเท่านั้น แต่ยังพบในชั้น L2 และ L3 ด้านบนด้วย (รูปที่เสริม 8b) รูปแบบของสัญญาณ GA ที่ตรวจพบใน SAM โดยใช้ qmRGA ยังคงไม่เปลี่ยนแปลงเมื่อเวลาผ่านไป (รูปที่เสริม 8c–f, k) แม้ว่าโครงสร้าง qd17mRGA จะถูกควบคุมลงอย่างเป็นระบบใน SAM ของพืช T3 จากห้าสายพันธุ์อิสระที่เราได้จำแนกลักษณะอย่างละเอียด แต่เราสามารถวิเคราะห์รูปแบบการเรืองแสงที่ได้จากโครงสร้าง pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP ได้ (รูปที่เสริม 8g–j, l) ในสายควบคุมนี้ ตรวจพบการเปลี่ยนแปลงเล็กน้อยในอัตราส่วนการเรืองแสงใน SAM แต่ในศูนย์ SAM เราสังเกตเห็นการลดลงอย่างชัดเจนและไม่คาดคิดของ VENUS ที่เกี่ยวข้องกับ TagBFP สิ่งนี้ยืนยันว่ารูปแบบการส่งสัญญาณที่สังเกตโดย qmRGA สะท้อนถึงการเสื่อมสภาพของ mRGA-VENUS ที่ขึ้นอยู่กับ GA แต่ยังแสดงให้เห็นว่า qmRGA อาจประเมินกิจกรรมการส่งสัญญาณของ GA ในศูนย์เนื้อเยื่อเจริญสูงเกินไป สรุปได้ว่า ผลการศึกษาของเราเผยให้เห็นรูปแบบการส่งสัญญาณของ GA ที่สะท้อนการกระจายตัวของ primordia เป็นหลัก การกระจายตัวของบริเวณระหว่าง primordial (IPR) นี้เกิดจากการสร้างกิจกรรมการส่งสัญญาณของ GA ระดับสูงอย่างค่อยเป็นค่อยไประหว่าง primordium ที่กำลังพัฒนาและบริเวณส่วนกลาง ในขณะเดียวกัน กิจกรรมการส่งสัญญาณของ GA ใน primordium ก็ลดลง (รูปที่ 4c, d)
การกระจายตัวของตัวรับ GID1b และ GID1c (ดูด้านบน) ชี้ให้เห็นว่าการแสดงออกที่แตกต่างกันของตัวรับ GA ช่วยกำหนดรูปแบบกิจกรรมการส่งสัญญาณของ GA ใน SAM เราสงสัยว่าการสะสมที่แตกต่างกันของ GA อาจมีส่วนเกี่ยวข้องหรือไม่ เพื่อตรวจสอบความเป็นไปได้นี้ เราใช้เซ็นเซอร์ nlsGPS1 GA FRET21 ตรวจพบความถี่ในการกระตุ้นที่เพิ่มขึ้นใน SAM ของ nlsGPS1 ที่ได้รับ GA4+7 ความเข้มข้น 10 ไมโครโมลาร์ เป็นเวลา 100 นาที (ภาพเสริม 9a-e) ซึ่งบ่งชี้ว่า nlsGPS1 ตอบสนองต่อการเปลี่ยนแปลงความเข้มข้นของ GA ใน SAM เช่นเดียวกับในราก21 การกระจายตัวเชิงพื้นที่ของความถี่ในการกระตุ้นของ nlsGPS1 เผยให้เห็นระดับ GA ที่ค่อนข้างต่ำในชั้นนอกของ SAM แต่พบว่าระดับ GA สูงขึ้นที่บริเวณกึ่งกลางและบริเวณขอบของ SAM (รูปที่ 4e และภาพเสริม 9a, c) สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่า GA มีการกระจายตัวใน SAM ด้วยรูปแบบเชิงพื้นที่ที่เทียบเคียงได้กับที่ตรวจพบโดย qmRGA เพื่อเป็นแนวทางเสริม เราได้ใช้ GA เรืองแสง (GA3-, GA4-, GA7-Fl) หรือ Fl เพียงอย่างเดียวเป็นตัวควบคุมเชิงลบกับ SAM สัญญาณ Fl กระจายตัวไปทั่ว SAM รวมถึงบริเวณส่วนกลางและบริเวณปฐมภูมิ แม้ว่าจะมีความเข้มต่ำกว่า (รูปที่ 4j และรูปเสริม 10d) ในทางตรงกันข้าม GA-Fl ทั้งสามชนิดสะสมตัวเฉพาะภายในขอบเขตปฐมภูมิและในระดับที่แตกต่างกันในส่วนที่เหลือของ IPR โดย GA7-Fl สะสมอยู่ในโดเมนที่ใหญ่ที่สุดใน IPR (รูปที่ 4k และรูปเสริม 10a,b) การหาปริมาณความเข้มของการเรืองแสงพบว่าอัตราส่วนความเข้มของ IPR ต่อความเข้มที่ไม่ IPR สูงกว่าใน SAM ที่ได้รับ GA-Fl เมื่อเทียบกับ SAM ที่ได้รับ Fl (รูปที่ 4l และรูปเสริม 10c) ผลการศึกษาเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า GA มีความเข้มข้นสูงกว่าในเซลล์ IPR ที่อยู่ใกล้กับขอบอวัยวะมากที่สุด ซึ่งชี้ให้เห็นว่ารูปแบบกิจกรรมการส่งสัญญาณของ SAM GA เป็นผลมาจากทั้งการแสดงออกของตัวรับ GA ที่แตกต่างกัน และการสะสมของ GA ที่แตกต่างกันในเซลล์ IPR ที่อยู่ใกล้กับขอบอวัยวะ ดังนั้น การวิเคราะห์ของเราจึงเผยให้เห็นรูปแบบการส่งสัญญาณของ GA ทั้งในเชิงปริภูมิและเวลาโดยไม่คาดคิด โดยมีกิจกรรมที่ลดลงในศูนย์กลางและปริภูมิแรกของ SAM และมีกิจกรรมที่สูงขึ้นใน IPR ในบริเวณรอบนอก
เพื่อทำความเข้าใจบทบาทของกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ที่แตกต่างกันในเซลล์ SAM เราได้วิเคราะห์ความสัมพันธ์ระหว่างกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA การขยายตัวของเซลล์ และการแบ่งเซลล์โดยใช้การถ่ายภาพแบบไทม์แลปส์แบบเรียลไทม์ของ SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS เมื่อพิจารณาถึงบทบาทของ GA ในการควบคุมการเจริญเติบโต คาดว่าจะมีความสัมพันธ์เชิงบวกกับพารามิเตอร์การขยายตัวของเซลล์ ดังนั้น เราจึงเปรียบเทียบแผนที่กิจกรรมการส่งสัญญาณ GA กับแผนที่อัตราการเติบโตของพื้นผิวเซลล์ (ซึ่งเป็นตัวแทนของความแรงของการขยายตัวของเซลล์สำหรับเซลล์ที่กำหนดและสำหรับเซลล์ลูกขณะแบ่งตัว) และแผนที่แอนไอโซทรอปิกของการเจริญเติบโต ซึ่งวัดทิศทางการขยายตัวของเซลล์ (ซึ่งใช้สำหรับเซลล์ที่กำหนดและสำหรับเซลล์ลูกขณะแบ่งตัวเช่นกัน รูปที่ 5a, b ดูวิธีการและวิธีการเสริม) แผนที่อัตราการเติบโตของพื้นผิวเซลล์ SAM ของเราสอดคล้องกับการสังเกตก่อนหน้านี้38,39 โดยมีอัตราการเจริญเติบโตต่ำสุดที่ขอบเซลล์และอัตราการเจริญเติบโตสูงสุดในดอกไม้ที่กำลังพัฒนา (รูปที่ 5a) การวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก (PCA) แสดงให้เห็นว่ากิจกรรมการส่งสัญญาณของ GA มีความสัมพันธ์เชิงลบกับความเข้มของการเจริญเติบโตบนพื้นผิวเซลล์ (รูปที่ 5c) นอกจากนี้ เรายังแสดงให้เห็นว่าแกนหลักของความแปรผัน ซึ่งรวมถึงอินพุตของการส่งสัญญาณของ GA และความเข้มของการเจริญเติบโต ตั้งฉากกับทิศทางที่กำหนดโดยการแสดงออกของ CLV3 ที่สูง ซึ่งยืนยันการแยกเซลล์ออกจากศูนย์กลาง SAM ในการวิเคราะห์ที่เหลือ การวิเคราะห์สหสัมพันธ์แบบสเปียร์แมนยืนยันผล PCA (รูปที่ 5d) ซึ่งบ่งชี้ว่าสัญญาณ GA ที่สูงขึ้นใน IPR ไม่ได้ส่งผลให้เซลล์ขยายตัวมากขึ้น อย่างไรก็ตาม การวิเคราะห์สหสัมพันธ์เผยให้เห็นความสัมพันธ์เชิงบวกเล็กน้อยระหว่างกิจกรรมการส่งสัญญาณของ GA และค่าแอนไอโซทรอปีของการเจริญเติบโต (รูปที่ 5c, d) ซึ่งชี้ให้เห็นว่าการส่งสัญญาณ GA ที่สูงขึ้นใน IPR มีอิทธิพลต่อทิศทางการเติบโตของเซลล์และอาจส่งผลต่อตำแหน่งของระนาบการแบ่งเซลล์
a, b แผนที่ความร้อนของค่าเฉลี่ยการเจริญเติบโตบนพื้นผิว (a) และค่าแอนไอโซทรอปิกของการเจริญเติบโตบนพื้นผิว (b) ใน SAM เฉลี่ยจากพืชอิสระเจ็ดต้น (ใช้เป็นตัวแทนสำหรับความแข็งแรงและทิศทางการขยายตัวของเซลล์ตามลำดับ) c การวิเคราะห์ PCA ประกอบด้วยตัวแปรต่อไปนี้: สัญญาณ GA, ความเข้มการเจริญเติบโตบนพื้นผิว, ค่าแอนไอโซทรอปิกของการเจริญเติบโตบนพื้นผิว และการแสดงออกของ CLV3 ส่วนประกอบ PCA 1 ส่วนใหญ่มีความสัมพันธ์เชิงลบกับความเข้มการเจริญเติบโตบนพื้นผิวและมีความสัมพันธ์เชิงบวกกับสัญญาณ GA ส่วนประกอบ PCA 2 ส่วนใหญ่มีความสัมพันธ์เชิงบวกกับค่าแอนไอโซทรอปิกของการเจริญเติบโตบนพื้นผิวและมีความสัมพันธ์เชิงลบกับการแสดงออกของ CLV3 เปอร์เซ็นต์แสดงถึงความแปรผันที่อธิบายโดยแต่ละส่วนประกอบ d การวิเคราะห์สหสัมพันธ์แบบสเปียร์แมนระหว่างสัญญาณ GA, ความเข้มการเจริญเติบโตบนพื้นผิว และค่าแอนไอโซทรอปิกของการเจริญเติบโตบนพื้นผิวในระดับเนื้อเยื่อ ไม่รวม CZ ตัวเลขทางด้านขวาคือค่า Spearman rho ระหว่างสองตัวแปร เครื่องหมายดอกจันหมายถึงกรณีที่ความสัมพันธ์/ความสัมพันธ์เชิงลบมีความสำคัญอย่างมาก e การสร้างภาพสามมิติของเซลล์ Col-0 SAM L1 ด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคัล ผนังเซลล์ใหม่ที่เกิดขึ้นใน SAM (แต่ไม่ใช่เซลล์ต้นกำเนิด) ที่เวลา 10 ชั่วโมง จะถูกระบายสีตามค่ามุม แถบสีแสดงอยู่ที่มุมขวาล่าง ภาพแทรกแสดงภาพสามมิติที่สอดคล้องกันที่เวลา 0 ชั่วโมง การทดลองซ้ำสองครั้งและได้ผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกัน f กราฟกล่องแสดงอัตราการแบ่งตัวของเซลล์ใน SAM Col-0 IPR และ SAM ที่ไม่ใช่ IPR (n = 10 ต้นที่เป็นอิสระต่อกัน) เส้นกึ่งกลางแสดงค่ามัธยฐาน และขอบเขตกล่องแสดงเปอร์เซ็นไทล์ที่ 25 และ 75 หนวดแสดงค่าต่ำสุดและสูงสุดที่กำหนดโดยซอฟต์แวร์ R ค่า P ได้จากการทดสอบ t-test แบบสองหางของ Welch g, h แผนภาพแสดง (g) วิธีการวัดมุมของผนังเซลล์ใหม่ (สีม่วงแดง) เทียบกับทิศทางรัศมีจากจุดศูนย์กลางของ SAM (เส้นประสีขาว) (พิจารณาเฉพาะค่ามุมแหลม เช่น 0–90°) และ (h) ทิศทางเส้นรอบวง/ด้านข้างและทิศทางรัศมีภายในเนื้อเยื่อเจริญ i ฮิสโทแกรมความถี่ของการวางแนวระนาบการแบ่งเซลล์ข้าม SAM (สีน้ำเงินเข้ม) IPR (สีน้ำเงินกลาง) และไม่ใช่ IPR (สีน้ำเงินอ่อน) ตามลำดับ ค่า P ได้มาจากการทดสอบ Kolmogorov-Smirnov แบบสองหาง การทดลองซ้ำสองครั้งได้ผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกัน j ฮิสโทแกรมความถี่ของการวางแนวระนาบการแบ่งเซลล์ของ IPR รอบ P3 (สีเขียวอ่อน) P4 (สีเขียวกลาง) และ P5 (สีเขียวเข้ม) ตามลำดับ ค่า P ได้มาจากการทดสอบ Kolmogorov-Smirnov แบบสองหาง การทดลองซ้ำสองครั้งได้ผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกัน
ดังนั้น เราจึงศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างการส่งสัญญาณของ GA และกิจกรรมการแบ่งเซลล์ต่อไป โดยการระบุผนังเซลล์ที่เพิ่งสร้างขึ้นใหม่ระหว่างการทดสอบ (รูปที่ 5e) วิธีการนี้ทำให้เราสามารถวัดความถี่และทิศทางของการแบ่งเซลล์ได้ ที่น่าประหลาดใจคือ เราพบว่าความถี่ของการแบ่งเซลล์ใน IPR และส่วนที่เหลือของ SAM (เซลล์ที่ไม่ใช่ IPR, รูปที่ 5f) มีความคล้ายคลึงกัน ซึ่งบ่งชี้ว่าความแตกต่างของการส่งสัญญาณของ GA ระหว่างเซลล์ IPR และเซลล์ที่ไม่ใช่ IPR ไม่มีผลต่อการแบ่งเซลล์อย่างมีนัยสำคัญ สิ่งนี้และความสัมพันธ์เชิงบวกระหว่างการส่งสัญญาณของ GA และความสัมพันธ์แบบแอนไอโซทรอปีของการเจริญเติบโต กระตุ้นให้เราพิจารณาว่ากิจกรรมการส่งสัญญาณของ GA สามารถมีอิทธิพลต่อทิศทางของระนาบการแบ่งเซลล์ได้หรือไม่ เราวัดทิศทางของผนังเซลล์ใหม่เป็นมุมแหลมเทียบกับแกนรัศมีที่เชื่อมระหว่างจุดศูนย์กลางของเนื้อเยื่อเจริญและจุดศูนย์กลางของผนังเซลล์ใหม่ (รูปที่ 5e-i) และสังเกตเห็นแนวโน้มที่ชัดเจนของเซลล์ที่จะแบ่งตัวที่มุมเกือบ 90° เทียบกับแกนรัศมี โดยพบความถี่สูงสุดที่ 70–80° (23.28%) และ 80–90° (22.62%) (รูปที่ 5e,i) ซึ่งสอดคล้องกับการแบ่งตัวของเซลล์ในทิศทางเส้นรอบวง/แนวขวาง (รูปที่ 5h) เพื่อตรวจสอบการมีส่วนร่วมของการส่งสัญญาณ GA ต่อพฤติกรรมการแบ่งตัวของเซลล์นี้ เราได้วิเคราะห์พารามิเตอร์การแบ่งตัวของเซลล์ใน IPR และ non-IPR แยกกัน (รูปที่ 5i) เราพบว่าการกระจายตัวของมุมการแบ่งเซลล์ในเซลล์ IPR แตกต่างจากเซลล์ที่ไม่ใช่ IPR หรือในเซลล์ใน SAM ทั้งหมด โดยเซลล์ IPR แสดงสัดส่วนของการแบ่งเซลล์ด้านข้าง/วงกลมสูงกว่า คือ 70–80° และ 80–90° (33.86% และ 30.71% ตามลำดับ ซึ่งเป็นสัดส่วนที่สอดคล้องกัน) (รูปที่ 5i) ดังนั้น การสังเกตของเราจึงเผยให้เห็นความสัมพันธ์ระหว่างการส่งสัญญาณ GA ระดับสูงและการวางแนวระนาบการแบ่งเซลล์ใกล้กับทิศทางรอบวง คล้ายกับความสัมพันธ์ระหว่างกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA และแอนไอโซทรอปิกของการเจริญเติบโต (รูปที่ 5c, d) เพื่อศึกษาการอนุรักษ์เชิงพื้นที่ของความสัมพันธ์นี้เพิ่มเติม เราได้วัดการวางแนวระนาบการแบ่งเซลล์ในเซลล์ IPR รอบปฐมภูมิโดยเริ่มจาก P3 เนื่องจากตรวจพบกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA สูงสุดในบริเวณนี้โดยเริ่มจาก P4 (รูปที่ 4) มุมการแบ่งตัวของ IPR รอบ P3 และ P4 ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ แม้ว่าจะพบความถี่ของการแบ่งตัวของเซลล์ด้านข้างที่เพิ่มขึ้นใน IPR รอบ P4 (รูปที่ 5j) อย่างไรก็ตาม ในเซลล์ IPR รอบ P5 ความแตกต่างของทิศทางของระนาบการแบ่งตัวของเซลล์มีนัยสำคัญทางสถิติ โดยความถี่ของการแบ่งตัวของเซลล์ตามขวางเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็ว (รูปที่ 5j) ผลการศึกษาเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการส่งสัญญาณ GA สามารถควบคุมทิศทางของการแบ่งตัวของเซลล์ใน SAM ได้ ซึ่งสอดคล้องกับรายงานก่อนหน้านี้40,41 ที่ระบุว่าการส่งสัญญาณ GA สูงสามารถเหนี่ยวนำให้เกิดทิศทางของการแบ่งตัวของเซลล์ด้านข้างใน IPR ได้
คาดการณ์ว่าเซลล์ใน IPR จะไม่รวมตัวกันใน primordia แต่จะรวมตัวกันใน internodes2,42,43 การแบ่งเซลล์ใน IPR ที่วางตัวตามขวางอาจส่งผลให้เกิดการจัดเรียงตัวของเซลล์ epidermal เรียงตัวเป็นแถวขนานตามยาวใน internodes การสังเกตของเราที่อธิบายไว้ข้างต้นชี้ให้เห็นว่าการส่งสัญญาณของ GA น่าจะมีบทบาทในกระบวนการนี้ โดยการควบคุมทิศทางของการแบ่งเซลล์
การสูญเสียการทำงานของยีน DELLA หลายยีนส่งผลให้เกิดการตอบสนองของ GA อย่างต่อเนื่อง และสามารถใช้ยีนกลายพันธุ์ della เพื่อทดสอบสมมติฐานนี้ได้44 ขั้นแรก เราได้วิเคราะห์รูปแบบการแสดงออกของยีน DELLA ห้ายีนใน SAM การหลอมรวมของยีน GUS45 แสดงให้เห็นว่า GAI, RGA, RGL1 และ RGL2 (ในระดับที่น้อยกว่ามาก) มีการแสดงออกใน SAM (ภาพเสริม 11a-d) ไฮบริดิเซชันแบบ in situ แสดงให้เห็นเพิ่มเติมว่า mRNA ของ GAI สะสมเฉพาะใน primordia และดอกที่กำลังพัฒนา (ภาพเสริม 11e) ตรวจพบ mRNA ของ RGL1 และ RGL3 ทั่วทั้งเรือนยอดของ SAM และในดอกที่แก่กว่า ในขณะที่ mRNA ของ RGL2 พบมากในบริเวณขอบ (ภาพเสริม 11f-h) การถ่ายภาพแบบคอนโฟคอลของ pRGL3::RGL3-GFP SAM ยืนยันการแสดงออกที่สังเกตได้จากการผสมพันธุ์แบบ in situ และแสดงให้เห็นว่าโปรตีน RGL3 สะสมในส่วนกลางของ SAM (ภาพเสริม 11i) เมื่อใช้สาย pRGA::GFP-RGA เรายังพบว่าโปรตีน RGA สะสมใน SAM แต่ปริมาณโปรตีนจะลดลงที่ขอบเริ่มต้นจาก P4 (ภาพเสริม 11j) ที่น่าสังเกตคือ รูปแบบการแสดงออกของ RGL3 และ RGA สอดคล้องกับกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ที่สูงขึ้นใน IPR ซึ่งตรวจพบโดย qmRGA (รูปที่ 4) ยิ่งไปกว่านั้น ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่า DELLA ทั้งหมดมีการแสดงออกใน SAM และการแสดงออกของพวกมันครอบคลุมทั่วทั้ง SAM
จากนั้นเราได้วิเคราะห์พารามิเตอร์การแบ่งเซลล์ใน SAM ชนิดป่า (Ler, กลุ่มควบคุม) และกลายพันธุ์ gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) (รูปที่ 6a, b) ที่น่าสนใจคือ เราสังเกตเห็นการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติในการกระจายความถี่ของมุมการแบ่งเซลล์ใน SAM ชนิดป่า della กลายพันธุ์ เมื่อเทียบกับชนิดป่า (รูปที่ 6c) การเปลี่ยนแปลงนี้ในกลายพันธุ์ della กลายพันธุ์ เกิดจากความถี่ที่เพิ่มขึ้นของมุม 80–90° (34.71% เทียบกับ 24.55%) และในระดับที่น้อยกว่าคือมุม 70–80° (23.78% เทียบกับ 20.18%) ซึ่งสอดคล้องกับการแบ่งเซลล์ตามขวาง (รูปที่ 6c) ความถี่ของการแบ่งเซลล์แบบไม่ตามขวาง (0–60°) ก็ลดลงในมิวแทนต์เดลลาโกลบอล (รูปที่ 6c) ความถี่ของการแบ่งเซลล์ตามขวางเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญใน SAM ของมิวแทนต์เดลลาโกลบอล (รูปที่ 6b) ความถี่ของการแบ่งเซลล์ตามขวางใน IPR ก็สูงขึ้นในมิวแทนต์เดลลาโกลบอลเช่นกันเมื่อเทียบกับมิวแทนต์แบบไวลด์ไทป์ (รูปที่ 6d) นอกบริเวณ IPR มิวแทนต์แบบไวลด์ไทป์มีการกระจายของมุมการแบ่งเซลล์ที่สม่ำเสมอกว่า ในขณะที่มิวแทนต์เดลลาโกลบอลชอบการแบ่งเซลล์แบบสัมผัส เช่น IPR (รูปที่ 6e) นอกจากนี้ เรายังวัดทิศทางของการแบ่งเซลล์ใน SAM ของมิวแทนต์ควินทูเพิล ga2 oxidase (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 และ ga2ox6-2) ซึ่งเป็นมิวแทนต์พื้นหลังที่ไม่มีฤทธิ์ต่อ GA ซึ่งมีการสะสมของ GA สอดคล้องกับการเพิ่มขึ้นของระดับ GA ค่า SAM ของช่อดอกกลายพันธุ์ควินทูเพิล ga2ox มีขนาดใหญ่กว่าของ Col-0 (ภาพเสริม 12a, b) และเมื่อเปรียบเทียบกับ Col-0 ค่า SAM ของควินทูเพิล ga2ox แสดงการกระจายตัวของมุมการแบ่งเซลล์ที่แตกต่างอย่างชัดเจน โดยความถี่ของมุมเพิ่มขึ้นจาก 50° เป็น 90° ซึ่งเอื้อต่อการแบ่งเซลล์แบบสัมผัส (ภาพเสริม 12a–c) ดังนั้น เราจึงแสดงให้เห็นว่าการกระตุ้นการส่งสัญญาณ GA และการสะสมของ GA อย่างต่อเนื่องทำให้เกิดการแบ่งเซลล์ด้านข้างใน IPR และส่วนที่เหลือของ SAM
ก, ข ภาพสามมิติของชั้น L1 ของ SAM ที่ย้อมด้วย PI (ก) และ della mutant ทั่วโลก (ข) โดยใช้กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล ผนังเซลล์ใหม่ที่เกิดขึ้นใน SAM (แต่ไม่ใช่ primordium) เป็นเวลา 10 ชั่วโมง จะแสดงและระบายสีตามค่ามุม ภาพแทรกแสดง SAM ที่เวลา 0 ชั่วโมง แถบสีแสดงอยู่ที่มุมขวาล่าง ลูกศรใน (ข) ชี้ไปที่ตัวอย่างของไฟล์เซลล์ที่เรียงตัวกันใน della mutant ทั่วโลก การทดลองนี้ทำซ้ำสองครั้งโดยได้ผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกัน ce การเปรียบเทียบการกระจายความถี่ของทิศทางระนาบการแบ่งเซลล์ใน SAM ทั้งหมด (ง), IPR (จ) และ non-IPR (ฉ) ระหว่าง Ler และ della ทั่วโลก ค่า P ได้มาจากการทดสอบ Kolmogorov-Smirnov แบบสองหาง f, g การสร้างภาพสามมิติของภาพคอนโฟคัลของ SAM ที่ย้อมด้วย PI ของพืชทรานสเจนิก Col-0 (i) และ pCUC2::gai-1-VENUS (j) แผง (a, b) แสดงผนังเซลล์ใหม่ (แต่ไม่ใช่ primordia) ที่เกิดขึ้นใน SAM ภายใน 10 ชั่วโมง การทดลองซ้ำสองครั้งและได้ผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกัน h–j การเปรียบเทียบการกระจายความถี่ของทิศทางระนาบการแบ่งเซลล์ใน SAM ทั้งหมด (h), IPR (i) และ non-IPR (j) ระหว่างพืช Col-0 และ pCUC2::gai-1-VENUS ค่า P ได้จากการทดสอบ Kolmogorov–Smirnov แบบสองหาง
จากนั้นเราได้ทดสอบผลของการยับยั้งการส่งสัญญาณ GA โดยเฉพาะใน IPR ด้วยเหตุนี้ เราจึงใช้โปรโมเตอร์ cotyledon cup 2 (CUC2) เพื่อกระตุ้นการแสดงออกของโปรตีน gai-1 เชิงลบที่เด่นซึ่งหลอมรวมกับ VENUS (ในสายพันธุ์ pCUC2::gai-1-VENUS) ใน SAM แบบไวลด์ไทป์ โปรโมเตอร์ CUC2 กระตุ้นการแสดงออกของ IPR ส่วนใหญ่ใน SAM รวมถึงเซลล์ขอบ ตั้งแต่ P4 เป็นต้นไป และพบการแสดงออกจำเพาะที่คล้ายคลึงกันในต้น pCUC2::gai-1-VENUS (ดูด้านล่าง) การกระจายตัวของมุมการแบ่งเซลล์ทั่ว SAM หรือ IPR ของต้น pCUC2::gai-1-VENUS ไม่แตกต่างจากต้นไวลด์ไทป์อย่างมีนัยสำคัญ แม้ว่าเราจะพบอย่างไม่คาดคิดว่าเซลล์ที่ไม่มี IPR ในต้นเหล่านี้แบ่งตัวที่ความถี่สูงกว่าที่ 80–90° (รูปที่ 6f–j)
มีข้อเสนอแนะว่าทิศทางการแบ่งเซลล์ขึ้นอยู่กับรูปทรงเรขาคณิตของ SAM โดยเฉพาะอย่างยิ่งแรงดึงที่เกิดจากความโค้งของเนื้อเยื่อ46 ดังนั้นเราจึงตั้งคำถามว่ารูปร่างของ SAM เปลี่ยนแปลงไปในพืชเดลลาโกลบอลมิวแทนต์และ pCUC2::gai-1-VENUS หรือไม่ ดังที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้12 ขนาดของ SAM เดลลาโกลบอลมิวแทนต์มีขนาดใหญ่กว่าของชนิดไวด์ไทป์ (ภาพเสริม 13a, b, d) การผสมพันธุ์แบบ in situ ของ CLV3 และ STM RNA ยืนยันการขยายตัวของเนื้อเยื่อเจริญในเซลล์เดลลามิวแทนต์ และยังแสดงให้เห็นการขยายตัวด้านข้างของช่องเซลล์ต้นกำเนิด (ภาพเสริม 13e, f, h, i) อย่างไรก็ตาม ความโค้งของ SAM มีความคล้ายคลึงกันในทั้งสองจีโนไทป์ (ภาพเสริม 13k, m, n, p) เราสังเกตเห็นการเพิ่มขึ้นของขนาดที่คล้ายคลึงกันในยีนกลายพันธุ์ gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple โดยไม่มีการเปลี่ยนแปลงความโค้งเมื่อเทียบกับยีนชนิดปกติ (ภาพเสริม 13c, d, g, j, l, o, p) ความถี่ของทิศทางการแบ่งเซลล์ได้รับผลกระทบในยีนกลายพันธุ์ della quadruple เช่นกัน แต่ในระดับที่น้อยกว่าในยีนกลายพันธุ์ della monolithic (ภาพเสริม 12d-f) ผลของปริมาณยานี้ ประกอบกับการไม่มีผลต่อความโค้ง ชี้ให้เห็นว่ากิจกรรม RGL3 ที่เหลืออยู่ในยีนกลายพันธุ์ Della quadruple จำกัดการเปลี่ยนแปลงทิศทางการแบ่งเซลล์ที่เกิดจากการสูญเสียกิจกรรม DELLA และการเปลี่ยนแปลงของการแบ่งเซลล์ด้านข้างเกิดขึ้นเพื่อตอบสนองต่อการเปลี่ยนแปลงของกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA มากกว่าการเปลี่ยนแปลงในรูปทรงเรขาคณิตของ SAM ดังที่ได้อธิบายไว้ข้างต้น โปรโมเตอร์ CUC2 กระตุ้นการแสดงออกของ IPR ใน SAM โดยเริ่มต้นที่ P4 (ภาพเสริม 14a, b) และในทางตรงกันข้าม SAM ของ pCUC2::gai-1-VENUS มีขนาดลดลงแต่มีความโค้งสูงกว่า (ภาพเสริม 14c-h) การเปลี่ยนแปลงสัณฐานวิทยาของ SAM ของ pCUC2::gai-1-VENUS นี้อาจส่งผลให้การกระจายตัวของความเค้นเชิงกลแตกต่างไปจากแบบปกติ ซึ่งความเค้นรอบวงสูงเริ่มต้นที่ระยะทางสั้นกว่าจากศูนย์กลาง SAM47 อีกทางเลือกหนึ่ง การเปลี่ยนแปลงสัณฐานวิทยาของ SAM ของ pCUC2::gai-1-VENUS อาจเป็นผลมาจากการเปลี่ยนแปลงคุณสมบัติเชิงกลของบริเวณที่ถูกเหนี่ยวนำโดยการแสดงออกของทรานส์ยีน48 ในทั้งสองกรณี สิ่งนี้อาจชดเชยผลกระทบของการเปลี่ยนแปลงในการส่งสัญญาณ GA ได้บางส่วน โดยเพิ่มโอกาสที่เซลล์จะแบ่งตัวในทิศทางรอบวง/ตามขวาง ซึ่งเป็นคำอธิบายข้อสังเกตของเรา
เมื่อพิจารณาโดยรวมแล้ว ข้อมูลของเรายืนยันว่าการส่งสัญญาณ GA ที่สูงขึ้นมีบทบาทสำคัญในการวางแนวด้านข้างของระนาบการแบ่งเซลล์ใน IPR นอกจากนี้ยังแสดงให้เห็นว่าความโค้งของเนื้อเยื่อเจริญยังมีอิทธิพลต่อการวางแนวของระนาบการแบ่งเซลล์ใน IPR อีกด้วย
การวางแนวขวางของระนาบการแบ่งเซลล์ใน IPR อันเนื่องมาจากกิจกรรมการส่งสัญญาณของ GA ที่สูง ชี้ให้เห็นว่า GA ได้จัดระบบไฟล์เซลล์รัศมีล่วงหน้าในชั้นหนังกำพร้าภายใน SAM เพื่อกำหนดโครงสร้างของเซลล์ที่จะพบในปล้องชั้นหนังกำพร้าในภายหลัง อันที่จริง ไฟล์เซลล์ดังกล่าวมักพบเห็นได้ในภาพ SAM ของยีนกลายพันธุ์เดลลาโกลบอล (รูปที่ 6b) ดังนั้น เพื่อศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับหน้าที่การพัฒนาของรูปแบบเชิงพื้นที่ของการส่งสัญญาณของ GA ใน SAM เราจึงใช้การถ่ายภาพแบบไทม์แลปส์เพื่อวิเคราะห์โครงสร้างเชิงพื้นที่ของเซลล์ใน IPR ในพืชชนิดป่า (Ler และ Col-0) ยีนกลายพันธุ์เดลลาโกลบอล และพืชดัดแปลงพันธุกรรม pCUC2::gai-1-VENUS
เราพบว่า qmRGA แสดงให้เห็นว่ากิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ใน IPR เพิ่มขึ้นจาก P1/P2 และสูงสุดที่ P4 และรูปแบบนี้คงที่ตลอดเวลา (รูปที่ 4a–f และรูปเสริม 8c–f, k) เพื่อวิเคราะห์โครงสร้างเชิงพื้นที่ของเซลล์ใน IPR ที่มีสัญญาณ GA เพิ่มขึ้น เราได้ติดฉลากเซลล์ Ler IPR ไว้ด้านบนและด้านข้างของ P4 ตามสถานะการพัฒนาที่วิเคราะห์ 34 ชั่วโมงหลังจากการสังเกตครั้งแรก กล่าวคือ มากกว่าสองครั้งของพลาสติด ทำให้เราสามารถติดตามเซลล์ IPR ในระหว่างการพัฒนาขั้นต้นจาก P1/P2 ไปยัง P4 ได้ เราใช้สีสามสีที่แตกต่างกัน: สีเหลืองสำหรับเซลล์ที่รวมเข้ากับขั้นต้นใกล้กับ P4 สีเขียวสำหรับเซลล์ที่อยู่ใน IPR และสีม่วงสำหรับเซลล์ที่มีส่วนร่วมในทั้งสองกระบวนการ (รูปที่ 7a–c) ที่ t0 (0 ชั่วโมง) จะเห็นเซลล์ IPR 1–2 ชั้นอยู่ด้านหน้า P4 (รูปที่ 7a) ตามที่คาดไว้ เมื่อเซลล์เหล่านี้แบ่งตัว เซลล์ส่วนใหญ่แบ่งตัวผ่านระนาบการแบ่งตัวตามขวาง (รูปที่ 7a–c) ผลที่คล้ายกันได้มาจากการใช้ Col-0 SAM (โดยเน้นที่ P3 ซึ่งมีรอยพับที่ขอบคล้ายกับ P4 ใน Ler) แม้ว่าในจีโนไทป์นี้ รอยพับที่เกิดขึ้นที่ขอบดอกจะซ่อนเซลล์ IPR ได้เร็วกว่า (รูปที่ 7g–i) ดังนั้น รูปแบบการแบ่งตัวของเซลล์ IPR จึงจัดเซลล์เป็นแถวรัศมีก่อน เช่นเดียวกับในปล้อง การจัดเรียงตัวของแถวรัศมีและตำแหน่งของเซลล์ IPR ระหว่างอวัยวะที่ต่อเนื่องกันชี้ให้เห็นว่าเซลล์เหล่านี้เป็นเซลล์ตั้งต้นของปล้อง
ที่นี่ เราได้พัฒนา qmRGA ซึ่งเป็นไบโอเซนเซอร์การส่งสัญญาณ GA แบบอัตราส่วน ซึ่งช่วยให้สามารถระบุกิจกรรมการส่งสัญญาณของ GA เชิงปริมาณที่เกิดจากความเข้มข้นของ GA และตัวรับ GA ร่วมกัน พร้อมกับลดการรบกวนวิถีการส่งสัญญาณภายในเซลล์ให้น้อยที่สุด จึงให้ข้อมูลเกี่ยวกับการทำงานของ GA ในระดับเซลล์ ด้วยเหตุนี้ เราจึงได้สร้างโปรตีน DELLA ดัดแปลงที่เรียกว่า mRGA ซึ่งสูญเสียความสามารถในการจับกับคู่ปฏิสัมพันธ์ของ DELLA แต่ยังคงมีความไวต่อการสลายโปรตีนที่เกิดจาก GA qmRGA ตอบสนองต่อการเปลี่ยนแปลงของระดับ GA ทั้งจากภายนอกและภายในเซลล์ และคุณสมบัติการตรวจจับแบบไดนามิกของมันช่วยให้สามารถประเมินการเปลี่ยนแปลงเชิงพื้นที่และเวลาในกิจกรรมการส่งสัญญาณของ GA ในระหว่างการพัฒนาได้ qmRGA ยังเป็นเครื่องมือที่มีความยืดหยุ่นสูง เนื่องจากสามารถปรับให้เข้ากับเนื้อเยื่อต่างๆ ได้โดยการเปลี่ยนโปรโมเตอร์ที่ใช้ในการแสดงออก (หากจำเป็น) และเนื่องจากวิถีการส่งสัญญาณ GA และโมทีฟ PFYRE ที่ยังคงสภาพเดิมในพืชดอก จึงมีแนวโน้มที่จะถ่ายโอนไปยังพืชชนิดอื่นได้22 สอดคล้องกับสิ่งนี้ การกลายพันธุ์ที่เทียบเท่ากันในโปรตีน DELLA ของข้าว SLR1 (HYY497AAA) แสดงให้เห็นว่าสามารถยับยั้งการทำงานของสารยับยั้งการเจริญเติบโตของ SLR1 ได้ ในขณะที่ลดการย่อยสลายที่เกิดจาก GA ลงเพียงเล็กน้อย คล้ายกับ mRGA23 การศึกษาล่าสุดใน Arabidopsis แสดงให้เห็นว่าการกลายพันธุ์ของกรดอะมิโนเพียงตัวเดียวในโดเมน PFYRE (S474L) ทำให้กิจกรรมการถอดรหัสของ RGA เปลี่ยนแปลงไปโดยไม่ส่งผลกระทบต่อความสามารถในการทำปฏิกิริยากับคู่ของปัจจัยการถอดรหัส50 แม้ว่าการกลายพันธุ์นี้จะใกล้เคียงกับการแทนที่กรดอะมิโน 3 ตัวที่พบใน mRGA มาก แต่การศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่าการกลายพันธุ์ทั้งสองนี้ทำให้ลักษณะเฉพาะของ DELLA เปลี่ยนแปลงไป แม้ว่าพันธมิตรปัจจัยการถอดรหัสส่วนใหญ่จะจับกับโดเมน LHR1 และ SAW ของ DELLA26,51 แต่กรดอะมิโนที่ได้รับการอนุรักษ์บางส่วนในโดเมน PFYRE อาจช่วยทำให้ปฏิสัมพันธ์เหล่านี้มีเสถียรภาพ
การพัฒนาปล้องเป็นลักษณะสำคัญในโครงสร้างและการปรับปรุงผลผลิตของพืช qmRGA เผยให้เห็นกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ที่สูงขึ้นในเซลล์ต้นกำเนิดปล้อง IPR จากการผสมผสานการถ่ายภาพเชิงปริมาณและพันธุศาสตร์ เราแสดงให้เห็นว่ารูปแบบการส่งสัญญาณ GA ซ้อนทับระนาบการแบ่งเซลล์แบบวงกลม/ขวางในชั้นหนังกำพร้า SAM ซึ่งกำหนดโครงสร้างการแบ่งเซลล์ที่จำเป็นสำหรับการพัฒนาปล้อง มีการค้นพบตัวควบคุมการวางแนวระนาบการแบ่งเซลล์หลายตัวในระหว่างการพัฒนา52,53 งานวิจัยของเราแสดงตัวอย่างที่ชัดเจนว่ากิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ควบคุมพารามิเตอร์ของเซลล์นี้อย่างไร DELLA สามารถโต้ตอบกับโปรตีนเชิงซ้อนแบบ prefolding ได้41 ดังนั้นการส่งสัญญาณ GA อาจควบคุมการวางแนวระนาบการแบ่งเซลล์โดยมีอิทธิพลโดยตรงต่อการวางแนวไมโครทูบูลของคอร์เทกซ์40,41,54,55 เราแสดงให้เห็นอย่างไม่คาดคิดว่าใน SAM ความสัมพันธ์ระหว่างกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ที่สูงขึ้นไม่ได้อยู่ที่การยืดตัวหรือการแบ่งเซลล์ แต่เป็นเพียงความต่างของการเจริญเติบโต ซึ่งสอดคล้องกับผลโดยตรงของ GA ต่อทิศทางการแบ่งเซลล์ใน IPR อย่างไรก็ตาม เราไม่สามารถตัดความเป็นไปได้ที่ผลกระทบนี้อาจเป็นทางอ้อมได้ เช่น เกิดจากการอ่อนตัวของผนังเซลล์ที่เกิดจาก GA56 การเปลี่ยนแปลงคุณสมบัติของผนังเซลล์ทำให้เกิดความเครียดเชิงกล57,58 ซึ่งสามารถส่งผลต่อการวางแนวของระนาบการแบ่งเซลล์โดยส่งผลต่อการวางแนวของไมโครทูบูลในคอร์เทกซ์39,46,59 ผลรวมของความเครียดเชิงกลที่เกิดจาก GA และการควบคุมการวางแนวของไมโครทูบูลโดยตรงโดย GA อาจเกี่ยวข้องกับการสร้างรูปแบบการวางแนวการแบ่งเซลล์ที่เฉพาะเจาะจงใน IPR เพื่อกำหนดปล้อง และจำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อทดสอบแนวคิดนี้ ในทำนองเดียวกัน การศึกษาก่อนหน้านี้ได้เน้นย้ำถึงความสำคัญของโปรตีน TCP14 และ 15 ที่มีปฏิสัมพันธ์กับ DELLA ในการควบคุมการก่อตัวของปล้อง60,61 และปัจจัยเหล่านี้อาจเป็นตัวกลางการทำงานของ GA ร่วมกับ BREVIPEDICELLUS (BP) และ PENNYWISE (PNY) ซึ่งควบคุมการพัฒนาของปล้องและได้รับการพิสูจน์แล้วว่ามีอิทธิพลต่อการส่งสัญญาณของ GA2,62 เนื่องจาก DELLA โต้ตอบกับบราสซิโนสเตียรอยด์ เอทิลีน กรดจัสมอนิก และทางเดินสัญญาณกรดแอบซิซิก (ABA)63,64 และฮอร์โมนเหล่านี้สามารถส่งผลต่อการวางแนวของไมโครทูบูล65 ผลกระทบของ GA ต่อการวางแนวการแบ่งเซลล์อาจเกิดจากฮอร์โมนอื่นๆ ได้เช่นกัน
การศึกษาทางเซลล์วิทยาในระยะแรกแสดงให้เห็นว่าทั้งบริเวณด้านในและด้านนอกของ SAM ของ Arabidopsis จำเป็นต่อการพัฒนาของปล้อง (internode)2,42 ความจริงที่ว่า GA ควบคุมการแบ่งเซลล์ในเนื้อเยื่อด้านในอย่างแข็งขัน12 สนับสนุนหน้าที่สองประการของ GA ในการควบคุมเนื้อเยื่อเจริญและขนาดของปล้องใน SAM รูปแบบการแบ่งเซลล์แบบมีทิศทางก็ถูกควบคุมอย่างเข้มงวดในเนื้อเยื่อ SAM ด้านในเช่นกัน และการควบคุมนี้เป็นสิ่งจำเป็นต่อการเจริญเติบโตของลำต้น52 น่าสนใจที่จะตรวจสอบว่า GA มีบทบาทในการกำหนดทิศทางของระนาบการแบ่งเซลล์ในโครงสร้าง SAM ด้านในหรือไม่ ซึ่งจะทำให้เกิดการประสานกันของการกำหนดและการพัฒนาของปล้องภายใน SAM
เพาะเลี้ยงพืชในหลอดทดลองในดินหรืออาหารเลี้ยงเชื้อ Murashige-Skoog (MS) 1 มื้อ (Duchefa) เสริมด้วยซูโครส 1% และวุ้น 1% (Sigma) ภายใต้สภาวะมาตรฐาน (แสง 16 ชั่วโมง, 22 องศาเซลเซียส) ยกเว้นการทดลองการเจริญเติบโตของไฮโปโคทิลและราก ซึ่งเพาะต้นกล้าบนจานเพาะเลี้ยงแนวตั้งภายใต้แสงคงที่และอุณหภูมิ 22 องศาเซลเซียส สำหรับการทดลองไนเตรต เพาะเลี้ยงพืชในอาหารเลี้ยงเชื้อ MS ดัดแปลง (อาหารเลี้ยงเชื้อ bioWORLD) เสริมด้วยไนเตรตที่เพียงพอ (KNO3 0 หรือ 10 มิลลิโมลาร์), NH4-ซัคซิเนต 0.5 มิลลิโมลาร์, ซูโครส 1% และวุ้น A-1% (Sigma) ภายใต้สภาวะวันยาว
cDNA ของ GID1a ที่แทรกเข้าไปใน pDONR221 ถูกนำมารวมเข้ากับ pDONR P4-P1R-pUBQ10 และ pDONR P2R-P3-mCherry ใน pB7m34GW เพื่อสร้าง pUBQ10::GID1a-mCherry DNA ของ IDD2 ที่แทรกเข้าไปใน pDONR221 ถูกนำมารวมเข้ากับ pB7RWG266 เพื่อสร้าง p35S:IDD2-RFP ในการสร้าง pGID1b::2xmTQ2-GID1b จะต้องขยายชิ้นส่วนขนาด 3.9 กิโลเบสที่อยู่ต้นน้ำของบริเวณเข้ารหัส GID1b และชิ้นส่วนขนาด 4.7 กิโลเบสที่มี cDNA ของ GID1b (1.3 กิโลเบส) และเทอร์มิเนเตอร์ (3.4 กิโลเบส) ก่อนโดยใช้ไพรเมอร์ในตารางเสริมที่ 3 จากนั้นจึงแทรกเข้าไปใน pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) และ pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) ตามลำดับ และสุดท้ายจึงรวมเข้ากับ pDONR221 2xmTQ268 ในเวกเตอร์เป้าหมาย pGreen 012567 โดยใช้การโคลนเกตเวย์ เพื่อสร้าง pCUC2::LSSmOrange ลำดับโปรโมเตอร์ CUC2 (3229 bp ก่อน ATG) ตามด้วยลำดับการเข้ารหัสของ mOrange ขนาดใหญ่ที่เลื่อน Stokes (LSSmOrange)69 ที่มีสัญญาณการแปลตำแหน่งนิวเคลียส N7 และตัวหยุดการถอดรหัส NOS ถูกประกอบเป็นเวกเตอร์เป้าหมาย pGreen kanamycin โดยใช้ระบบการรวมตัว 3-fragment Gateway (Invitrogen) เวกเตอร์ไบนารีของพืชถูกนำเข้าสู่ Agrobacterium tumefaciens สายพันธุ์ GV3101 และถูกนำเข้าสู่ใบ Nicotiana benthamiana โดยวิธีการแทรกซึมของ Agrobacterium และเข้าสู่ Arabidopsis thaliana Col-0 โดยวิธีการจุ่มดอกตามลำดับ pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry และ pCLV3::mCherry-NLS qmRGA ถูกแยกออกจากลูกผสม F3 และ F1 ของลูกผสมตามลำดับ
RNA in situ hybridization ดำเนินการบนปลายยอดยาวประมาณ 1 ซม.72 ซึ่งเก็บและตรึงทันทีในสารละลาย FAA (ฟอร์มาลดีไฮด์ 3.7%, กรดอะซิติก 5%, เอทานอล 50%) ที่ทำให้เย็นลงก่อนถึง 4 °C หลังจากทำการดูดสูญญากาศ 2 ครั้ง เป็นเวลา 15 นาที เปลี่ยนสารตรึงและบ่มตัวอย่างข้ามคืน สังเคราะห์ cDNA ของ GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 และ RGL3 และโพรบ antisense กับ 3'-UTR โดยใช้ไพรเมอร์ที่แสดงในตารางเสริม 3 ตามที่ Rosier และคณะ73 อธิบายไว้ โพรบที่ติดฉลากด้วย Digoxigenin ได้รับการตรวจจับทางภูมิคุ้มกันโดยใช้แอนติบอดี digoxigenin (เจือจาง 3,000 เท่า; Roche, หมายเลขแค็ตตาล็อก: 11 093 274 910) และส่วนต่างๆ ได้รับการย้อมด้วยสารละลาย 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP, เจือจาง 250 เท่า)/nitroblue tetrazolium (NBT, เจือจาง 200 เท่า)