ไบโอเซนเซอร์วัดปริมาณจิบเบอเรลลินเผยให้เห็นบทบาทของจิบเบอเรลลินในการกำหนดโครงสร้างปล้องในเนื้อเยื่อเจริญปลายยอด

การเจริญเติบโตของเนื้อเยื่อเจริญปลายยอด (SAM) มีความสำคัญอย่างยิ่งต่อโครงสร้างของลำต้น ฮอร์โมนพืชจิบเบอเรลลินกรดแกมมานิก (GA) มีบทบาทสำคัญในการประสานการเจริญเติบโตของพืช แต่บทบาทของ GA ในเนื้อเยื่อปลายยอด (SAM) ยังไม่เป็นที่เข้าใจอย่างถ่องแท้ ในงานวิจัยนี้ เราได้พัฒนาไบโอเซนเซอร์แบบอัตราส่วนสำหรับการส่งสัญญาณ GA โดยการดัดแปลงโปรตีน DELLA เพื่อยับยั้งการทำงานควบคุมที่สำคัญในกระบวนการตอบสนองการถอดรหัสของ GA ในขณะที่ยังคงรักษาการสลายตัวเมื่อมีการตรวจจับ GA เราแสดงให้เห็นว่าไบโอเซนเซอร์แบบอาศัยการสลายตัวนี้สามารถบันทึกการเปลี่ยนแปลงระดับ GA และการรับรู้ของเซลล์ได้อย่างแม่นยำในระหว่างการพัฒนา เราใช้ไบโอเซนเซอร์นี้ในการทำแผนที่กิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ใน SAM เราแสดงให้เห็นว่าสัญญาณ GA สูงส่วนใหญ่อยู่ในเซลล์ที่อยู่ระหว่างกลุ่มเซลล์ต้นกำเนิดอวัยวะ ซึ่งเป็นเซลล์ตั้งต้นของเซลล์ปล้อง โดยใช้แนวทางการเพิ่มและลดการทำงาน เรายังแสดงให้เห็นเพิ่มเติมว่า GA ควบคุมทิศทางของระนาบการแบ่งเซลล์ สร้างโครงสร้างเซลล์แบบดั้งเดิมของปล้อง ซึ่งส่งเสริมการกำหนดลักษณะของปล้องใน SAM
เนื้อเยื่อเจริญปลายยอด (SAM) ซึ่งตั้งอยู่ที่ปลายยอด ประกอบด้วยกลุ่มเซลล์ต้นกำเนิดที่มีกิจกรรมสร้างอวัยวะด้านข้างและข้อลำต้นในลักษณะที่เป็นโมดูลและวนซ้ำตลอดช่วงชีวิตของพืช แต่ละหน่วยที่ซ้ำกันเหล่านี้ หรือข้อพืช ประกอบด้วยปล้องและอวัยวะด้านข้างที่ข้อ และเนื้อเยื่อเจริญซอกใบในซอกใบ¹ การเจริญเติบโตและการจัดระเบียบของข้อพืชเปลี่ยนแปลงไปตามการพัฒนา ในอาราบิโดปซิส การเจริญเติบโตของปล้องถูกยับยั้งในช่วงระยะเจริญเติบโต และเนื้อเยื่อเจริญซอกใบจะยังคงอยู่เฉยๆ ในซอกใบของใบโรเซ็ต ในช่วงเปลี่ยนผ่านไปสู่ระยะออกดอก SAM จะกลายเป็นเนื้อเยื่อเจริญช่อดอก สร้างปล้องและตาซอกใบที่ยาวขึ้น กิ่งก้านในซอกใบของใบที่ลำต้น และต่อมาคือดอกไม้ที่ไม่มีใบ² แม้ว่าเราจะมีความก้าวหน้าอย่างมากในการทำความเข้าใจกลไกที่ควบคุมการเกิดใบ ดอก และกิ่งก้าน แต่ความรู้เกี่ยวกับวิธีการเกิดปล้องนั้นยังมีค่อนข้างน้อย
การทำความเข้าใจการกระจายตัวของ GA ในเชิงพื้นที่และเวลาจะช่วยให้เข้าใจหน้าที่ของฮอร์โมนเหล่านี้ในเนื้อเยื่อต่างๆ และในระยะการพัฒนาที่แตกต่างกันได้ดียิ่งขึ้น การมองเห็นการสลายตัวของฟิวชั่น RGA-GFP ที่แสดงออกภายใต้การทำงานของโปรโมเตอร์ของมันเองให้ข้อมูลที่สำคัญเกี่ยวกับการควบคุมระดับ GA ทั้งหมดในราก15,16 อย่างไรก็ตาม การแสดงออกของ RGA แตกต่างกันไปในแต่ละเนื้อเยื่อ17 และถูกควบคุมโดย GA18 ดังนั้น การแสดงออกที่แตกต่างกันของโปรโมเตอร์ RGA อาจส่งผลให้เกิดรูปแบบการเรืองแสงที่สังเกตได้ด้วย RGA-GFP และด้วยเหตุนี้ วิธีนี้จึงไม่ใช่เชิงปริมาณ เมื่อไม่นานมานี้ GA ที่ติดฉลากด้วยฟลูออเรสซีน (Fl) ที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพ19,20 เผยให้เห็นการสะสมของ GA ในเอนโดคอร์เทกซ์ของรากและการควบคุมระดับเซลล์โดยการขนส่ง GA ล่าสุด เซนเซอร์ GA FRET nlsGPS1 แสดงให้เห็นว่าระดับ GA สัมพันธ์กับการยืดตัวของเซลล์ในราก เส้นใย และไฮโปโคทิลที่เติบโตในที่มืด21 อย่างไรก็ตาม ดังที่เราได้เห็นแล้ว ความเข้มข้นของ GA ไม่ใช่พารามิเตอร์เดียวที่ควบคุมกิจกรรมการส่งสัญญาณของ GA เนื่องจากขึ้นอยู่กับกระบวนการรับรู้ที่ซับซ้อน ในที่นี้ เราได้สร้างความเข้าใจเกี่ยวกับเส้นทางการส่งสัญญาณ DELLA และ GA และรายงานการพัฒนาและลักษณะเฉพาะของไบโอเซนเซอร์แบบอัตราส่วนที่อาศัยการย่อยสลายสำหรับการส่งสัญญาณ GA ในการพัฒนาไบโอเซนเซอร์เชิงปริมาณนี้ เราใช้ RGA กลายพันธุ์ที่ไวต่อ GA ซึ่งถูกเชื่อมต่อกับโปรตีนเรืองแสงและแสดงออกอย่างแพร่หลายในเนื้อเยื่อ รวมถึงโปรตีนเรืองแสงที่ไม่ไวต่อ GA เราแสดงให้เห็นว่าการเชื่อมต่อโปรตีน RGA กลายพันธุ์ไม่รบกวนการส่งสัญญาณ GA ภายในร่างกายเมื่อแสดงออกอย่างแพร่หลาย และไบโอเซนเซอร์นี้สามารถวัดปริมาณกิจกรรมการส่งสัญญาณที่เกิดจากทั้งอินพุต GA และการประมวลผลสัญญาณ GA โดยอุปกรณ์ตรวจจับด้วยความละเอียดเชิงพื้นที่และเวลาสูง เราใช้ไบโอเซนเซอร์นี้เพื่อสร้างแผนที่การกระจายตัวเชิงพื้นที่และเวลาของกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA และวัดปริมาณว่า GA ควบคุมพฤติกรรมของเซลล์ในชั้นหนังกำพร้าของ SAM อย่างไร เราแสดงให้เห็นว่า GA ควบคุมทิศทางของระนาบการแบ่งเซลล์ของเซลล์ SAM ที่อยู่ระหว่างต้นกำเนิดอวัยวะ ซึ่งเป็นการกำหนดโครงสร้างเซลล์แบบดั้งเดิมของปล้อง
สุดท้าย เราได้สอบถามว่า qmRGA สามารถรายงานการเปลี่ยนแปลงระดับ GA ภายในเซลล์โดยใช้ไฮโปโคทิลที่กำลังเจริญเติบโตได้หรือไม่ ก่อนหน้านี้เราได้แสดงให้เห็นแล้วว่าไนเตรตกระตุ้นการเจริญเติบโตโดยการเพิ่มการสังเคราะห์ GA และส่งผลให้เกิดการสลายตัวของ DELLA34 ดังนั้น เราจึงสังเกตว่าความยาวของไฮโปโคทิลในต้นกล้า pUBQ10::qmRGA ที่ปลูกภายใต้สภาวะที่มีไนเตรตอย่างเพียงพอ (10 mM NO3−) นั้นยาวกว่าอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับต้นกล้าที่ปลูกภายใต้สภาวะที่ขาดไนเตรต (ภาพประกอบเพิ่มเติมที่ 6a) สอดคล้องกับการตอบสนองต่อการเจริญเติบโต สัญญาณ GA นั้นสูงกว่าในไฮโปโคทิลของต้นกล้าที่ปลูกภายใต้สภาวะ 10 mM NO3− มากกว่าในต้นกล้าที่ปลูกในสภาวะที่ไม่มีไนเตรต (ภาพประกอบเพิ่มเติมที่ 6b, c) ดังนั้น qmRGA จึงช่วยให้สามารถตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงของสัญญาณ GA ที่เกิดจากการเปลี่ยนแปลงความเข้มข้นของ GA ภายในเซลล์ได้ด้วย
เพื่อทำความเข้าใจว่ากิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ที่ตรวจพบโดย qmRGA ขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของ GA และการรับรู้ GA หรือไม่ ตามที่คาดการณ์ไว้จากการออกแบบเซนเซอร์ เราจึงวิเคราะห์การแสดงออกของตัวรับ GID1 ทั้งสามชนิดในเนื้อเยื่อเจริญเติบโตและเนื้อเยื่อสืบพันธุ์ ในต้นกล้า สายพันธุ์รายงาน GID1-GUS แสดงให้เห็นว่า GID1a และ c มีการแสดงออกสูงในใบเลี้ยง (รูปที่ 3a–c) นอกจากนี้ ตัวรับทั้งสามชนิดยังแสดงออกในใบ รากแขนง ปลายราก (ยกเว้นหมวกรากของ GID1b) และระบบหลอดเลือด (รูปที่ 3a–c) ใน SAM ของช่อดอก เราตรวจพบสัญญาณ GUS เฉพาะสำหรับ GID1b และ 1c เท่านั้น (รูปเพิ่มเติมที่ 7a–c) การไฮบริดไดเซชันในแหล่งกำเนิดยืนยันรูปแบบการแสดงออกเหล่านี้และแสดงให้เห็นเพิ่มเติมว่า GID1c มีการแสดงออกอย่างสม่ำเสมอในระดับต่ำใน SAM ในขณะที่ GID1b แสดงการแสดงออกที่สูงกว่าที่บริเวณรอบนอกของ SAM (รูปเพิ่มเติมที่ 7d–l) ฟิวชั่นการแปล pGID1b::2xmTQ2-GID1b ยังเผยให้เห็นช่วงการแสดงออกของ GID1b ที่แตกต่างกัน ตั้งแต่การแสดงออกต่ำหรือไม่มีการแสดงออกเลยในใจกลางของ SAM ไปจนถึงการแสดงออกสูงที่ขอบของอวัยวะ (ภาพประกอบเพิ่มเติม 7m) ดังนั้น ตัวรับ GID1 จึงไม่ได้กระจายตัวอย่างสม่ำเสมอทั้งในและนอกเนื้อเยื่อ ในการทดลองต่อมา เรายังสังเกตเห็นว่าการแสดงออกของ GID1 ที่มากเกินไป (pUBQ10::GID1a-mCherry) เพิ่มความไวของ qmRGA ในไฮโปโคทิลต่อการใช้ GA จากภายนอก (รูปที่ 3d, e) ในทางตรงกันข้าม ฟลูออเรสเซนซ์ที่วัดโดย qd17mRGA ในไฮโปโคทิลไม่ไวต่อการรักษาด้วย GA3 (รูปที่ 3f, g) สำหรับการทดสอบทั้งสอง ต้นกล้าได้รับการรักษาด้วย GA ความเข้มข้นสูง (100 μM GA3) เพื่อประเมินพฤติกรรมที่รวดเร็วของเซนเซอร์ ซึ่งความสามารถในการจับกับตัวรับ GID1 จะเพิ่มขึ้นหรือลดลง โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้ยืนยันว่าไบโอเซนเซอร์ qmRGA ทำหน้าที่ผสมผสานกันทั้งเป็นเซนเซอร์ GA และเซนเซอร์ GA และชี้ให้เห็นว่าการแสดงออกที่แตกต่างกันของตัวรับ GID1 สามารถปรับเปลี่ยนการเปล่งแสงของเซนเซอร์ได้อย่างมีนัยสำคัญ
จนถึงปัจจุบัน การกระจายตัวของสัญญาณ GA ใน SAM ยังคงไม่ชัดเจน ดังนั้น เราจึงใช้พืชที่แสดงออก qmRGA และตัวรายงานเซลล์ต้นกำเนิด pCLV3::mCherry-NLS35 เพื่อคำนวณแผนที่เชิงปริมาณที่มีความละเอียดสูงของกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA โดยเน้นที่ชั้น L1 (หนังกำพร้า; รูปที่ 4a, b ดูวิธีการและวิธีการเสริม) เนื่องจาก L1 มีบทบาทสำคัญในการควบคุมการเจริญเติบโตของ SAM36 ในที่นี้ การแสดงออกของ pCLV3::mCherry-NLS ให้จุดอ้างอิงทางเรขาคณิตคงที่สำหรับการวิเคราะห์การกระจายตัวเชิงพื้นที่และเวลาของกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA37 แม้ว่า GA จะถือว่าจำเป็นสำหรับการพัฒนาอวัยวะด้านข้าง4 แต่เราสังเกตว่าสัญญาณ GA ต่ำในดอกตูม (P) ตั้งแต่ระยะ P3 เป็นต้นไป (รูปที่ 4a, b) ในขณะที่ดอกตูม P1 และ P2 ที่ยังอ่อนอยู่มีกิจกรรมปานกลางคล้ายกับในบริเวณกลาง (รูปที่ 4a, b) ตรวจพบกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ที่สูงขึ้นบริเวณขอบเขตของอวัยวะต้นกำเนิด โดยเริ่มที่ P1/P2 (ที่ด้านข้างของขอบเขต) และสูงสุดที่ P4 รวมถึงในเซลล์ทั้งหมดของบริเวณรอบนอกที่อยู่ระหว่างอวัยวะต้นกำเนิด (รูปที่ 4a, b และรูปประกอบเพิ่มเติมที่ 8a, b) กิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ที่สูงขึ้นนี้ไม่ได้พบเฉพาะในชั้นหนังกำพร้าเท่านั้น แต่ยังพบในชั้น L2 และชั้น L3 ตอนบนด้วย (รูปประกอบเพิ่มเติมที่ 8b) รูปแบบของสัญญาณ GA ที่ตรวจพบใน SAM โดยใช้ qmRGA ก็ยังคงไม่เปลี่ยนแปลงเมื่อเวลาผ่านไป (รูปประกอบเพิ่มเติมที่ 8c–f, k) แม้ว่าโครงสร้าง qd17mRGA จะถูกลดระดับลงอย่างเป็นระบบใน SAM ของพืช T3 จากห้าสายพันธุ์อิสระที่เราได้ทำการศึกษาอย่างละเอียด แต่เราก็สามารถวิเคราะห์รูปแบบการเรืองแสงที่ได้จากโครงสร้าง pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP ได้ (รูปประกอบเพิ่มเติมที่ 8g–j, l) ในสายควบคุมนี้ ตรวจพบการเปลี่ยนแปลงเพียงเล็กน้อยในอัตราส่วนการเรืองแสงใน SAM แต่ในศูนย์กลางของ SAM เราสังเกตเห็นการลดลงที่ชัดเจนและไม่คาดคิดของ VENUS ที่เกี่ยวข้องกับ TagBFP ซึ่งยืนยันว่ารูปแบบการส่งสัญญาณที่สังเกตได้โดย qmRGA สะท้อนถึงการสลายตัวของ mRGA-VENUS ที่ขึ้นอยู่กับ GA แต่ยังแสดงให้เห็นว่า qmRGA อาจประเมินกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ในศูนย์กลางของเนื้อเยื่อเจริญสูงเกินไป สรุปได้ว่า ผลลัพธ์ของเราเผยให้เห็นรูปแบบการส่งสัญญาณ GA ที่สะท้อนถึงการกระจายตัวของปุ่มเนื้อเยื่อเจริญเป็นหลัก การกระจายตัวของบริเวณระหว่างปุ่มเนื้อเยื่อเจริญ (IPR) นี้เกิดจากการค่อยๆ สร้างกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ที่สูงขึ้นระหว่างปุ่มเนื้อเยื่อเจริญที่กำลังพัฒนาและบริเวณศูนย์กลาง ในขณะเดียวกันกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ในปุ่มเนื้อเยื่อเจริญก็ลดลง (รูปที่ 4c, d)
การกระจายตัวของตัวรับ GID1b และ GID1c (ดูด้านบน) บ่งชี้ว่าการแสดงออกที่แตกต่างกันของตัวรับ GA ช่วยกำหนดรูปแบบกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ใน SAM เราสงสัยว่าการสะสม GA ที่แตกต่างกันอาจมีส่วนเกี่ยวข้องหรือไม่ เพื่อตรวจสอบความเป็นไปได้นี้ เราจึงใช้เซนเซอร์ nlsGPS1 GA FRET21 ตรวจพบความถี่การกระตุ้นที่เพิ่มขึ้นใน SAM ของ nlsGPS1 ที่ได้รับการบำบัดด้วย GA4+7 ความเข้มข้น 10 μM เป็นเวลา 100 นาที (ภาพประกอบเพิ่มเติม 9a–e) ซึ่งบ่งชี้ว่า nlsGPS1 ตอบสนองต่อการเปลี่ยนแปลงความเข้มข้นของ GA ใน SAM เช่นเดียวกับในราก21 การกระจายตัวเชิงพื้นที่ของความถี่การกระตุ้นของ nlsGPS1 เผยให้เห็นระดับ GA ที่ค่อนข้างต่ำในชั้นนอกของ SAM แต่แสดงให้เห็นว่ามีระดับสูงขึ้นในส่วนกลางและบริเวณขอบของ SAM (รูปที่ 4e และภาพประกอบเพิ่มเติม 9a,c) สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่า GA กระจายตัวอยู่ใน SAM ด้วยรูปแบบเชิงพื้นที่ที่เทียบเคียงได้กับที่เปิดเผยโดย qmRGA เพื่อเป็นแนวทางเสริม เรายังทำการทดลองโดยการบำบัด SAM ด้วย GA ที่เรืองแสง (GA3-, GA4-, GA7-Fl) หรือ Fl เพียงอย่างเดียวเป็นตัวควบคุมเชิงลบ สัญญาณ Fl กระจายตัวไปทั่ว SAM รวมถึงบริเวณกลางและส่วนเริ่มต้น แม้ว่าจะมีความเข้มต่ำกว่าก็ตาม (รูปที่ 4j และรูปประกอบเพิ่มเติมที่ 10d) ในทางตรงกันข้าม GA-Fl ทั้งสามชนิดสะสมตัวเฉพาะภายในขอบเขตของส่วนเริ่มต้นและในระดับที่แตกต่างกันในส่วนที่เหลือของ IPR โดย GA7-Fl สะสมตัวในโดเมนที่ใหญ่ที่สุดใน IPR (รูปที่ 4k และรูปประกอบเพิ่มเติมที่ 10a,b) การวัดปริมาณความเข้มของการเรืองแสงเผยให้เห็นว่าอัตราส่วนความเข้มของ IPR ต่อไม่ใช่ IPR สูงกว่าใน SAM ที่ได้รับการบำบัดด้วย GA-Fl เมื่อเทียบกับ SAM ที่ได้รับการบำบัดด้วย Fl เพียงอย่างเดียว (รูปที่ 4l และรูปประกอบเพิ่มเติมที่ 10c) โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า GA มีความเข้มข้นสูงกว่าในเซลล์ IPR ที่อยู่ใกล้กับขอบอวัยวะมากที่สุด นี่แสดงให้เห็นว่ารูปแบบการส่งสัญญาณ GA ของ SAM เกิดจากการแสดงออกที่แตกต่างกันของตัวรับ GA และการสะสมที่แตกต่างกันของ GA ในเซลล์ IPR ที่อยู่ใกล้ขอบอวัยวะ ดังนั้น การวิเคราะห์ของเราจึงเผยให้เห็นรูปแบบเชิงพื้นที่และเวลาที่ไม่คาดคิดของการส่งสัญญาณ GA โดยมีกิจกรรมต่ำกว่าในส่วนกลางและส่วนต้นกำเนิดของ SAM และมีกิจกรรมสูงกว่าใน IPR ในบริเวณรอบนอก
เพื่อทำความเข้าใจบทบาทของกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ที่แตกต่างกันใน SAM เราได้วิเคราะห์ความสัมพันธ์ระหว่างกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA การขยายตัวของเซลล์ และการแบ่งเซลล์โดยใช้การถ่ายภาพแบบไทม์แลปส์แบบเรียลไทม์ของ SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS เนื่องจากบทบาทของ GA ในการควบคุมการเจริญเติบโต จึงคาดว่าจะมีความสัมพันธ์เชิงบวกกับพารามิเตอร์การขยายตัวของเซลล์ ดังนั้น เราจึงเปรียบเทียบแผนที่กิจกรรมการส่งสัญญาณ GA กับแผนที่อัตราการเจริญเติบโตของพื้นผิวเซลล์ (ซึ่งเป็นตัวแทนของความแข็งแรงของการขยายตัวของเซลล์สำหรับเซลล์ที่กำหนดและสำหรับเซลล์ลูกที่แบ่งตัว) และกับแผนที่ความไม่สมมาตรของการเจริญเติบโต ซึ่งวัดทิศทางของการขยายตัวของเซลล์ (ใช้ในที่นี้สำหรับเซลล์ที่กำหนดและสำหรับเซลล์ลูกที่แบ่งตัวเช่นกัน รูปที่ 5a,b ดูวิธีการและวิธีการเสริม) แผนที่อัตราการเจริญเติบโตของพื้นผิวเซลล์ SAM ของเราสอดคล้องกับการสังเกตก่อนหน้านี้38,39 โดยมีอัตราการเจริญเติบโตต่ำสุดที่ขอบและอัตราการเจริญเติบโตสูงสุดในดอกไม้ที่กำลังพัฒนา (รูปที่ 5a) การวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก (PCA) แสดงให้เห็นว่ากิจกรรมการส่งสัญญาณ GA มีความสัมพันธ์เชิงลบกับความเข้มของการเจริญเติบโตบนพื้นผิวเซลล์ (รูปที่ 5c) นอกจากนี้ เรายังแสดงให้เห็นว่าแกนหลักของการเปลี่ยนแปลง รวมถึงการป้อนสัญญาณ GA และความเข้มของการเจริญเติบโตนั้นตั้งฉากกับทิศทางที่กำหนดโดยการแสดงออกของ CLV3 ในระดับสูง ซึ่งยืนยันการไม่รวมเซลล์จากศูนย์กลาง SAM ในการวิเคราะห์ที่เหลือ การวิเคราะห์ความสัมพันธ์แบบสเปียร์แมนยืนยันผลลัพธ์ของ PCA (รูปที่ 5d) ซึ่งบ่งชี้ว่าสัญญาณ GA ที่สูงขึ้นใน IPR ไม่ได้ส่งผลให้เซลล์ขยายตัวมากขึ้น อย่างไรก็ตาม การวิเคราะห์ความสัมพันธ์เผยให้เห็นความสัมพันธ์เชิงบวกเล็กน้อยระหว่างกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA และความไม่สมมาตรของการเจริญเติบโต (รูปที่ 5c, d) ซึ่งชี้ให้เห็นว่าสัญญาณ GA ที่สูงขึ้นใน IPR มีอิทธิพลต่อทิศทางการเจริญเติบโตของเซลล์และอาจรวมถึงตำแหน่งของระนาบการแบ่งเซลล์ด้วย
a, b แผนที่ความร้อนของการเจริญเติบโตเฉลี่ยของพื้นผิว (a) และความไม่สม่ำเสมอของการเจริญเติบโต (b) ใน SAM โดยเฉลี่ยจากพืชอิสระเจ็ดต้น (ใช้เป็นตัวแทนสำหรับความแข็งแรงและทิศทางของการขยายตัวของเซลล์ตามลำดับ) c การวิเคราะห์ PCA ประกอบด้วยตัวแปรต่อไปนี้: สัญญาณ GA, ความเข้มของการเจริญเติบโตของพื้นผิว, ความไม่สม่ำเสมอของการเจริญเติบโตของพื้นผิว และการแสดงออกของ CLV3 องค์ประกอบ PCA ที่ 1 มีความสัมพันธ์เชิงลบกับความเข้มของการเจริญเติบโตของพื้นผิวเป็นหลัก และมีความสัมพันธ์เชิงบวกกับสัญญาณ GA องค์ประกอบ PCA ที่ 2 มีความสัมพันธ์เชิงบวกกับความไม่สม่ำเสมอของการเจริญเติบโตของพื้นผิวเป็นหลัก และมีความสัมพันธ์เชิงลบกับการแสดงออกของ CLV3 เปอร์เซ็นต์แสดงถึงความแปรปรวนที่อธิบายได้โดยแต่ละองค์ประกอบ d การวิเคราะห์ความสัมพันธ์แบบสเปียร์แมนระหว่างสัญญาณ GA, ความเข้มของการเจริญเติบโตของพื้นผิว และความไม่สม่ำเสมอของการเจริญเติบโตของพื้นผิวในระดับเนื้อเยื่อโดยไม่รวม CZ ตัวเลขทางด้านขวาคือค่าสัมประสิทธิ์สเปียร์แมนโร (rho) ระหว่างสองตัวแปร เครื่องหมายดอกจันแสดงกรณีที่ความสัมพันธ์/ความสัมพันธ์เชิงลบมีความสำคัญอย่างมาก e. การแสดงภาพสามมิติของเซลล์ Col-0 SAM L1 ด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล ผนังเซลล์ใหม่ที่เกิดขึ้นใน SAM (แต่ไม่ใช่ในส่วนต้นอ่อน) ที่เวลา 10 ชั่วโมง จะถูกระบายสีตามค่ามุม แถบสีแสดงอยู่ในมุมล่างขวา ภาพแทรกแสดงภาพสามมิติที่สอดคล้องกันที่เวลา 0 ชั่วโมง การทดลองนี้ทำซ้ำสองครั้งโดยได้ผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกัน f. แผนภาพกล่องแสดงอัตราการแบ่งเซลล์ใน SAM ของ Col-0 ที่ได้รับ IPR และได้รับ 1PR (n = 10 ต้นพืชอิสระ) เส้นกลางแสดงค่ามัธยฐาน และขอบกล่องแสดงเปอร์เซ็นไทล์ที่ 25 และ 75 เส้นหนวดแสดงค่าต่ำสุดและสูงสุดที่กำหนดด้วยซอฟต์แวร์ R ค่า P ได้จากการทดสอบ t แบบสองด้านของ Welch g, h แผนภาพแสดง (g) วิธีการวัดมุมของผนังเซลล์ใหม่ (สีม่วงแดง) เทียบกับทิศทางรัศมีจากจุดศูนย์กลางของ SAM (เส้นประสีขาว) (พิจารณาเฉพาะค่ามุมแหลม คือ 0–90° เท่านั้น) และ (h) ทิศทางตามแนวเส้นรอบวง/ด้านข้างและแนวรัศมีภายในเนื้อเยื่อเจริญ i ฮิสโตแกรมความถี่ของการวางแนวระนาบการแบ่งเซลล์ข้าม SAM (สีน้ำเงินเข้ม), IPR (สีน้ำเงินกลาง) และไม่ใช่ IPR (สีน้ำเงินอ่อน) ตามลำดับ ค่า P ได้จากการทดสอบ Kolmogorov-Smirnov แบบสองด้าน การทดลองนี้ทำซ้ำสองครั้งโดยได้ผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกัน j ฮิสโตแกรมความถี่ของการวางแนวระนาบการแบ่งเซลล์ของ IPR รอบ P3 (สีเขียวอ่อน), P4 (สีเขียวกลาง) และ P5 (สีเขียวเข้ม) ตามลำดับ ค่า P ได้จากการทดสอบ Kolmogorov-Smirnov แบบสองด้าน การทดลองนี้ทำซ้ำสองครั้งโดยได้ผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกัน
ดังนั้น เราจึงทำการตรวจสอบความสัมพันธ์ระหว่างการส่งสัญญาณ GA และกิจกรรมการแบ่งเซลล์โดยการระบุผนังเซลล์ที่เกิดขึ้นใหม่ระหว่างการทดสอบ (รูปที่ 5e) วิธีนี้ทำให้เราสามารถวัดความถี่และทิศทางของการแบ่งเซลล์ได้ ที่น่าประหลาดใจคือ เราพบว่าความถี่ของการแบ่งเซลล์ใน IPR และส่วนที่เหลือของ SAM (ไม่ใช่ IPR รูปที่ 5f) มีความคล้ายคลึงกัน ซึ่งบ่งชี้ว่าความแตกต่างในการส่งสัญญาณ GA ระหว่างเซลล์ IPR และไม่ใช่ IPR ไม่ส่งผลกระทบต่อการแบ่งเซลล์อย่างมีนัยสำคัญ สิ่งนี้และความสัมพันธ์เชิงบวกระหว่างการส่งสัญญาณ GA และความไม่สม่ำเสมอของการเจริญเติบโต กระตุ้นให้เราพิจารณาว่ากิจกรรมการส่งสัญญาณ GA อาจส่งผลต่อทิศทางของระนาบการแบ่งเซลล์หรือไม่ เราวัดทิศทางของผนังเซลล์ใหม่เป็นมุมแหลมเมื่อเทียบกับแกนรัศมีที่เชื่อมต่อศูนย์กลางของเนื้อเยื่อเจริญและศูนย์กลางของผนังเซลล์ใหม่ (รูปที่ 5e-i) และสังเกตเห็นแนวโน้มที่ชัดเจนว่าเซลล์จะแบ่งตัวในมุมใกล้เคียง 90° เมื่อเทียบกับแกนรัศมี โดยมีความถี่สูงสุดที่ 70–80° (23.28%) และ 80–90° (22.62%) (รูปที่ 5e,i) ซึ่งสอดคล้องกับการแบ่งเซลล์ในทิศทางรอบวง/แนวขวาง (รูปที่ 5h) เพื่อตรวจสอบการมีส่วนร่วมของสัญญาณ GA ต่อพฤติกรรมการแบ่งเซลล์นี้ เราได้วิเคราะห์พารามิเตอร์การแบ่งเซลล์ใน IPR และ non-IPR แยกกัน (รูปที่ 5i) เราสังเกตว่าการกระจายมุมการแบ่งเซลล์ในเซลล์ IPR แตกต่างจากเซลล์ที่ไม่ใช่ IPR หรือเซลล์ใน SAM ทั้งหมด โดยเซลล์ IPR แสดงสัดส่วนการแบ่งเซลล์แบบด้านข้าง/วงกลมที่สูงกว่า กล่าวคือ 70–80° และ 80–90° (33.86% และ 30.71% ตามลำดับ) (รูปที่ 5i) ดังนั้น การสังเกตของเราจึงเผยให้เห็นความสัมพันธ์ระหว่างการส่งสัญญาณ GA ในระดับสูงกับการวางแนวระนาบการแบ่งเซลล์ที่ใกล้เคียงกับทิศทางรอบวง คล้ายกับความสัมพันธ์ระหว่างกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA และความไม่สม่ำเสมอของการเจริญเติบโต (รูปที่ 5c, d) เพื่อยืนยันการคงอยู่ของความสัมพันธ์นี้ในเชิงพื้นที่ เราได้วัดการวางแนวระนาบการแบ่งเซลล์ในเซลล์ IPR ที่อยู่รอบๆ ไพรมอร์เดียม เริ่มตั้งแต่ P3 เนื่องจากตรวจพบกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA สูงสุดในบริเวณนี้ เริ่มตั้งแต่ P4 (รูปที่ 4) มุมการแบ่งเซลล์ของ IPR บริเวณ P3 และ P4 ไม่แสดงความแตกต่างทางสถิติอย่างมีนัยสำคัญ แม้ว่าจะสังเกตเห็นความถี่ของการแบ่งเซลล์ด้านข้างที่เพิ่มขึ้นใน IPR บริเวณ P4 ก็ตาม (รูปที่ 5j) อย่างไรก็ตาม ในเซลล์ IPR บริเวณ P5 ความแตกต่างในทิศทางของระนาบการแบ่งเซลล์กลับมีนัยสำคัญทางสถิติ โดยมีความถี่ของการแบ่งเซลล์ตามแนวขวางเพิ่มขึ้นอย่างมาก (รูปที่ 5j) โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการส่งสัญญาณ GA สามารถควบคุมทิศทางของการแบ่งเซลล์ใน SAM ซึ่งสอดคล้องกับรายงานก่อนหน้านี้40,41 ที่ระบุว่าการส่งสัญญาณ GA ในระดับสูงสามารถกระตุ้นให้เกิดการแบ่งเซลล์ในแนวด้านข้างใน IPR ได้
มีการคาดการณ์ว่าเซลล์ใน IPR จะไม่ถูกรวมเข้ากับไพรมอร์เดีย แต่จะถูกรวมเข้ากับปล้อง2,42,43 การแบ่งเซลล์ในแนวขวางใน IPR อาจส่งผลให้เกิดการจัดเรียงเซลล์ผิวหนังเป็นแถวขนานตามแนวยาวในปล้อง การสังเกตของเราที่กล่าวมาข้างต้นชี้ให้เห็นว่าการส่งสัญญาณ GA น่าจะมีบทบาทในกระบวนการนี้โดยการควบคุมทิศทางการแบ่งเซลล์
การสูญเสียการทำงานของยีน DELLA หลายตัวส่งผลให้เกิดการตอบสนองต่อ GA อย่างต่อเนื่อง และสามารถใช้กลายพันธุ์ della เพื่อทดสอบสมมติฐานนี้ได้44 เราได้วิเคราะห์รูปแบบการแสดงออกของยีน DELLA ห้าตัวใน SAM ก่อน การรวมตัวของการถอดรหัสของสายพันธุ์ GUS45 เผยให้เห็นว่า GAI, RGA, RGL1 และ RGL2 (ในระดับที่น้อยกว่ามาก) ถูกแสดงออกใน SAM (ภาพประกอบเพิ่มเติม 11a–d) การไฮบริดไดเซชันในแหล่งกำเนิดแสดงให้เห็นเพิ่มเติมว่า mRNA ของ GAI สะสมเฉพาะในไพรมอร์เดียและดอกไม้ที่กำลังพัฒนา (ภาพประกอบเพิ่มเติม 11e) ตรวจพบ mRNA ของ RGL1 และ RGL3 ทั่วทั้งทรงพุ่ม SAM และในดอกไม้ที่แก่กว่า ในขณะที่ mRNA ของ RGL2 มีปริมาณมากกว่าในบริเวณขอบ (ภาพประกอบเพิ่มเติม 11f–h) การถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลของ pRGL3::RGL3-GFP SAM ยืนยันการแสดงออกที่สังเกตได้จากการไฮบริดไดเซชันในแหล่งกำเนิด และแสดงให้เห็นว่าโปรตีน RGL3 สะสมอยู่ในส่วนกลางของ SAM (ภาพประกอบเพิ่มเติมที่ 11i) เมื่อใช้สายพันธุ์ pRGA::GFP-RGA เรายังพบว่าโปรตีน RGA สะสมอยู่ใน SAM แต่ปริมาณของมันลดลงที่ขอบเขตเริ่มตั้งแต่ P4 (ภาพประกอบเพิ่มเติมที่ 11j) ที่น่าสังเกตคือ รูปแบบการแสดงออกของ RGL3 และ RGA สอดคล้องกับกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ที่สูงขึ้นใน IPR ดังที่ตรวจพบโดย qmRGA (รูปที่ 4) ยิ่งไปกว่านั้น ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่า DELLA ทั้งหมดแสดงออกใน SAM และการแสดงออกของพวกมันโดยรวมครอบคลุม SAM ทั้งหมด
ต่อไปเราได้วิเคราะห์พารามิเตอร์การแบ่งเซลล์ใน SAM ชนิดปกติ (Ler, ตัวควบคุม) และใน SAM กลายพันธุ์แบบห้าตัว (global) ของ della gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 (รูปที่ 6a, b) ที่น่าสนใจคือ เราสังเกตเห็นการเปลี่ยนแปลงที่มีนัยสำคัญทางสถิติในการกระจายความถี่ของมุมการแบ่งเซลล์ใน SAM กลายพันธุ์แบบ global ของ della เมื่อเทียบกับชนิดปกติ (รูปที่ 6c) การเปลี่ยนแปลงนี้ใน SAM กลายพันธุ์แบบ global ของ della เกิดจากการเพิ่มขึ้นของความถี่ของมุม 80–90° (34.71% เทียบกับ 24.55%) และในระดับที่น้อยกว่าคือมุม 70–80° (23.78% เทียบกับ 20.18%) ซึ่งสอดคล้องกับการแบ่งเซลล์ตามขวาง (รูปที่ 6c) ความถี่ของการแบ่งเซลล์ที่ไม่ใช่แนวขวาง (0–60°) ก็ลดลงในสายพันธุ์กลายพันธุ์ della global เช่นกัน (รูปที่ 6c) ความถี่ของการแบ่งเซลล์ในแนวขวางเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญใน SAM ของสายพันธุ์กลายพันธุ์ della global (รูปที่ 6b) ความถี่ของการแบ่งเซลล์ในแนวขวางใน IPR ก็สูงขึ้นในสายพันธุ์กลายพันธุ์ della global เมื่อเทียบกับสายพันธุ์ปกติ (รูปที่ 6d) นอกบริเวณ IPR สายพันธุ์ปกติมีการกระจายของมุมการแบ่งเซลล์ที่สม่ำเสมอกว่า ในขณะที่สายพันธุ์กลายพันธุ์ della global ชอบการแบ่งเซลล์แบบสัมผัสเช่นเดียวกับ IPR (รูปที่ 6e) เรายังได้วัดปริมาณการวางแนวของการแบ่งเซลล์ใน SAM ของสายพันธุ์กลายพันธุ์ ga2 oxidase (ga2ox) แบบห้าตัว (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 และ ga2ox6-2) ซึ่งเป็นสายพันธุ์กลายพันธุ์ที่ GA ไม่ทำงานแต่มีการสะสมของ GA สอดคล้องกับการเพิ่มขึ้นของระดับ GA เนื้อเยื่อเจริญปลายยอด (SAM) ของช่อดอกกลายพันธุ์ ga2ox แบบห้าเท่ามีขนาดใหญ่กว่าของ Col-0 (ภาพประกอบเพิ่มเติมที่ 12a, b) และเมื่อเปรียบเทียบกับ Col-0 เนื้อเยื่อเจริญปลายยอดของ ga2ox แบบห้าเท่าแสดงให้เห็นการกระจายตัวของมุมการแบ่งเซลล์ที่แตกต่างอย่างชัดเจน โดยความถี่ของมุมเพิ่มขึ้นจาก 50° เป็น 90° ซึ่งแสดงให้เห็นว่าการแบ่งเซลล์แบบสัมผัสมีแนวโน้มมากขึ้น (ภาพประกอบเพิ่มเติมที่ 12a–c) ดังนั้น เราจึงแสดงให้เห็นว่าการกระตุ้นอย่างต่อเนื่องของสัญญาณ GA และการสะสมของ GA ชักนำให้เกิดการแบ่งเซลล์ด้านข้างใน IPR และส่วนที่เหลือของ SAM
a, b การแสดงภาพสามมิติของชั้น L1 ของ Ler ที่ย้อมด้วย PI (a) และ SAM ของกลายพันธุ์ della ทั่วร่างกาย (b) โดยใช้กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล ผนังเซลล์ใหม่ที่ก่อตัวขึ้นใน SAM (แต่ไม่ใช่ไพรมอร์เดียม) ในช่วงเวลา 10 ชั่วโมง แสดงและระบายสีตามค่ามุม ภาพแทรกแสดง SAM ที่เวลา 0 ชั่วโมง แถบสีแสดงอยู่ที่มุมล่างขวา ลูกศรใน (b) ชี้ไปยังตัวอย่างของแถวเซลล์ที่เรียงตัวกันในกลายพันธุ์ della ทั่วร่างกาย การทดลองนี้ทำซ้ำสองครั้งโดยได้ผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกัน ce การเปรียบเทียบการกระจายความถี่ของการวางแนวระนาบการแบ่งเซลล์ใน SAM ทั้งหมด (d), IPR (e) และไม่ใช่ IPR (f) ระหว่าง Ler และ della ทั่วร่างกาย ค่า P ได้รับโดยใช้การทดสอบ Kolmogorov-Smirnov แบบสองด้าน f, g การแสดงภาพสามมิติของภาพคอนโฟคอลของ SAM ที่ย้อมด้วย PI ของพืชดัดแปลงพันธุกรรม Col-0 (i) และ pCUC2::gai-1-VENUS (j) แผง (a, b) แสดงผนังเซลล์ใหม่ (แต่ไม่ใช่ไพรมอร์เดีย) ที่เกิดขึ้นใน SAM ภายใน 10 ชั่วโมง การทดลองนี้ทำซ้ำสองครั้งโดยได้ผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกัน h–j การเปรียบเทียบการกระจายความถี่ของทิศทางระนาบการแบ่งเซลล์ที่อยู่ใน SAM ทั้งหมด (h), IPR (i) และไม่ใช่ IPR (j) ระหว่างพืช Col-0 และ pCUC2::gai-1-VENUS ค่า P ได้รับโดยใช้การทดสอบ Kolmogorov–Smirnov แบบสองด้าน
ต่อไปเราได้ทดสอบผลของการยับยั้งการส่งสัญญาณ GA โดยเฉพาะใน IPR เพื่อจุดประสงค์นี้ เราใช้โปรโมเตอร์ cotyledon cup 2 (CUC2) ในการควบคุมการแสดงออกของโปรตีน gai-1 ที่มีฤทธิ์ยับยั้งแบบเด่น (dominant negative) ที่เชื่อมต่อกับ VENUS (ในสายพันธุ์ pCUC2::gai-1-VENUS) ใน SAM ของสายพันธุ์ป่า โปรโมเตอร์ CUC2 ควบคุมการแสดงออกของ IPR ส่วนใหญ่ใน SAM รวมถึงเซลล์ขอบ ตั้งแต่ P4 เป็นต้นไป และพบการแสดงออกที่เฉพาะเจาะจงในลักษณะเดียวกันในพืช pCUC2::gai-1-VENUS (ดูด้านล่าง) การกระจายของมุมการแบ่งเซลล์ทั่ว SAM หรือ IPR ของพืช pCUC2::gai-1-VENUS ไม่แตกต่างอย่างมีนัยสำคัญจากสายพันธุ์ป่า แม้ว่าเราจะพบโดยไม่คาดคิดว่าเซลล์ที่ไม่มี IPR ในพืชเหล่านี้แบ่งตัวด้วยความถี่ที่สูงกว่า คือ 80–90° (รูปที่ 6f–j)
มีการเสนอแนะว่าทิศทางการแบ่งเซลล์ขึ้นอยู่กับรูปทรงเรขาคณิตของ SAM โดยเฉพาะอย่างยิ่งแรงดึงที่เกิดจากความโค้งของเนื้อเยื่อ46 ดังนั้นเราจึงตั้งคำถามว่ารูปร่างของ SAM เปลี่ยนแปลงไปในต้นกลายพันธุ์ della global และต้น pCUC2::gai-1-VENUS หรือไม่ ดังที่ได้รายงานไว้ก่อนหน้านี้12 ขนาดของ SAM ในต้นกลายพันธุ์ della global มีขนาดใหญ่กว่าในต้นปกติ (ภาพประกอบเพิ่มเติม 13a, b, d) การไฮบริดไดเซชันในแหล่งกำเนิดของ RNA CLV3 และ STM ยืนยันการขยายตัวของเนื้อเยื่อเจริญในต้นกลายพันธุ์ della และยังแสดงให้เห็นถึงการขยายตัวด้านข้างของบริเวณเซลล์ต้นกำเนิด (ภาพประกอบเพิ่มเติม 13e, f, h, i) อย่างไรก็ตาม ความโค้งของ SAM มีความคล้ายคลึงกันในทั้งสองสายพันธุ์ (ภาพประกอบเพิ่มเติม 13k, m, n, p) เราสังเกตเห็นการเพิ่มขนาดที่คล้ายกันในกลายพันธุ์สี่เท่า gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della โดยไม่มีการเปลี่ยนแปลงความโค้งเมื่อเทียบกับชนิดปกติ (ภาพประกอบเพิ่มเติมที่ 13c, d, g, j, l, o, p) ความถี่ของการวางแนวการแบ่งเซลล์ก็ได้รับผลกระทบในกลายพันธุ์สี่เท่า della เช่นกัน แต่ในระดับที่น้อยกว่าในกลายพันธุ์โมโนลิธิก della (ภาพประกอบเพิ่มเติมที่ 12d–f) ผลกระทบจากปริมาณนี้ พร้อมกับการไม่มีผลกระทบต่อความโค้ง บ่งชี้ว่ากิจกรรม RGL3 ที่เหลืออยู่ในกลายพันธุ์สี่เท่า Della จำกัดการเปลี่ยนแปลงในการวางแนวการแบ่งเซลล์ที่เกิดจากการสูญเสียกิจกรรม DELLA และการเปลี่ยนแปลงในการแบ่งเซลล์ด้านข้างเกิดขึ้นเพื่อตอบสนองต่อการเปลี่ยนแปลงในกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA มากกว่าการเปลี่ยนแปลงในรูปทรงเรขาคณิตของ SAM ดังที่กล่าวมาข้างต้น โปรโมเตอร์ CUC2 กระตุ้นการแสดงออกของ IPR ใน SAM เริ่มต้นที่ P4 (ภาพประกอบเพิ่มเติม 14a, b) และในทางตรงกันข้าม SAM ของ pCUC2::gai-1-VENUS มีขนาดลดลงแต่มีความโค้งมากขึ้น (ภาพประกอบเพิ่มเติม 14c–h) การเปลี่ยนแปลงรูปร่างของ SAM ของ pCUC2::gai-1-VENUS นี้อาจส่งผลให้มีการกระจายของแรงทางกลที่แตกต่างกันเมื่อเทียบกับชนิดปกติ ซึ่งแรงตามแนวเส้นรอบวงสูงจะเริ่มต้นที่ระยะทางที่สั้นกว่าจากศูนย์กลางของ SAM47 หรืออีกทางหนึ่ง การเปลี่ยนแปลงรูปร่างของ SAM ของ pCUC2::gai-1-VENUS อาจเกิดจากการเปลี่ยนแปลงคุณสมบัติทางกลในระดับภูมิภาคที่เกิดจากการแสดงออกของทรานส์ยีน48 ในทั้งสองกรณีนี้ อาจช่วยชดเชยผลกระทบของการเปลี่ยนแปลงในการส่งสัญญาณ GA ได้บางส่วน โดยเพิ่มโอกาสที่เซลล์จะแบ่งตัวในแนวเส้นรอบวง/แนวขวาง ซึ่งอธิบายถึงข้อสังเกตของเรา
โดยสรุปแล้ว ข้อมูลของเรายืนยันว่าการส่งสัญญาณ GA ที่สูงขึ้นมีบทบาทสำคัญในการกำหนดทิศทางด้านข้างของระนาบการแบ่งเซลล์ใน IPR นอกจากนี้ยังแสดงให้เห็นว่าความโค้งของเนื้อเยื่อเจริญก็มีอิทธิพลต่อทิศทางของระนาบการแบ่งเซลล์ใน IPR ด้วยเช่นกัน
การวางแนวขวางของระนาบการแบ่งใน IPR อันเนื่องมาจากกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ที่สูง บ่งชี้ว่า GA จัดเตรียมแถวเซลล์แบบรัศมีในชั้นหนังกำพร้าภายใน SAM เพื่อกำหนดโครงสร้างเซลล์ที่จะพบในปล้องหนังกำพร้าในภายหลัง อันที่จริง แถวเซลล์ดังกล่าวปรากฏให้เห็นบ่อยครั้งในภาพ SAM ของกลายพันธุ์ della global (รูปที่ 6b) ดังนั้น เพื่อสำรวจหน้าที่การพัฒนาของรูปแบบเชิงพื้นที่ของการส่งสัญญาณ GA ใน SAM เพิ่มเติม เราจึงใช้การถ่ายภาพแบบไทม์แลปส์เพื่อวิเคราะห์โครงสร้างเชิงพื้นที่ของเซลล์ใน IPR ในพืชชนิดปกติ (Ler และ Col-0) กลายพันธุ์ della global และพืชดัดแปลงพันธุกรรม pCUC2::gai-1-VENUS
เราพบว่า qmRGA แสดงให้เห็นว่ากิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ใน IPR เพิ่มขึ้นจาก P1/P2 และถึงจุดสูงสุดที่ P4 และรูปแบบนี้คงที่ตลอดเวลา (รูปที่ 4a–f และรูปประกอบเพิ่มเติม 8c–f, k) เพื่อวิเคราะห์การจัดระเบียบเชิงพื้นที่ของเซลล์ใน IPR ที่มีสัญญาณ GA เพิ่มขึ้น เราได้ติดฉลากเซลล์ Ler IPR ด้านบนและด้านข้างของ P4 ตามชะตากรรมการพัฒนาที่วิเคราะห์ 34 ชั่วโมงหลังจากการสังเกตครั้งแรก นั่นคือ มากกว่าสองเท่าของเวลาพลาสติด ทำให้เราสามารถติดตามเซลล์ IPR ในระหว่างการพัฒนาของไพรมอร์เดียมจาก P1/P2 ถึง P4 เราใช้สีที่แตกต่างกันสามสี ได้แก่ สีเหลืองสำหรับเซลล์ที่รวมเข้ากับไพรมอร์เดียมใกล้ P4 สีเขียวสำหรับเซลล์ที่อยู่ใน IPR และสีม่วงสำหรับเซลล์ที่เข้าร่วมในทั้งสองกระบวนการ (รูปที่ 7a–c) ที่ t0 (0 ชั่วโมง) เซลล์ IPR 1–2 ชั้นสามารถมองเห็นได้อยู่ด้านหน้าของ P4 (รูปที่ 7a) ดังที่คาดไว้ เมื่อเซลล์เหล่านี้แบ่งตัว พวกมันจะแบ่งตัวโดยส่วนใหญ่ผ่านระนาบการแบ่งตัวตามขวาง (รูปที่ 7a–c) ได้ผลลัพธ์ที่คล้ายกันเมื่อใช้ Col-0 SAM (โดยเน้นที่ P3 ซึ่งมีขอบพับคล้ายกับ P4 ใน Ler) แม้ว่าในจีโนไทป์นี้ รอยพับที่เกิดขึ้นที่ขอบดอกจะซ่อนเซลล์ IPR ได้เร็วกว่า (รูปที่ 7g–i) ดังนั้น รูปแบบการแบ่งตัวของเซลล์ IPR จึงจัดระเบียบเซลล์เป็นแถวรัศมีล่วงหน้า เช่นเดียวกับในปล้อง การจัดระเบียบเป็นแถวรัศมีและการกระจายตัวของเซลล์ IPR ระหว่างอวัยวะที่ต่อเนื่องกัน บ่งชี้ว่าเซลล์เหล่านี้เป็นเซลล์ต้นกำเนิดของปล้อง
ในงานวิจัยนี้ เราได้พัฒนาไบโอเซนเซอร์ตรวจวัดสัญญาณ GA แบบอัตราส่วน (ratiometric GA signaling biosensor) ชื่อ qmRGA ซึ่งช่วยให้สามารถสร้างแผนที่เชิงปริมาณของกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ที่เกิดจากความเข้มข้นของ GA และตัวรับ GA ร่วมกัน ในขณะที่ลดการรบกวนจากเส้นทางการส่งสัญญาณภายในเซลล์ให้น้อยที่สุด จึงให้ข้อมูลเกี่ยวกับหน้าที่ของ GA ในระดับเซลล์ เพื่อจุดประสงค์นี้ เราได้สร้างโปรตีน DELLA ที่ดัดแปลงแล้ว ชื่อ mRGA ซึ่งสูญเสียความสามารถในการจับกับพันธมิตรที่ทำปฏิกิริยากับ DELLA แต่ยังคงไวต่อการสลายโปรตีนที่เกิดจาก GA qmRGA ตอบสนองต่อการเปลี่ยนแปลงระดับ GA ทั้งจากภายนอกและภายในเซลล์ และคุณสมบัติการตรวจวัดแบบไดนามิกของมันช่วยให้สามารถประเมินการเปลี่ยนแปลงเชิงพื้นที่และเวลาของกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ในระหว่างการพัฒนาได้ qmRGA ยังเป็นเครื่องมือที่มีความยืดหยุ่นสูงมาก เนื่องจากสามารถปรับให้เข้ากับเนื้อเยื่อต่างๆ ได้โดยการเปลี่ยนโปรโมเตอร์ที่ใช้สำหรับการแสดงออก (หากจำเป็น) และด้วยลักษณะที่อนุรักษ์ไว้ของเส้นทางการส่งสัญญาณ GA และโมทีฟ PFYRE ในพืชดอก จึงมีแนวโน้มที่จะสามารถถ่ายทอดไปยังสปีชีส์อื่นๆ ได้22 สอดคล้องกับเรื่องนี้ การกลายพันธุ์ที่เทียบเท่ากันในโปรตีน SLR1 DELLA ของข้าว (HYY497AAA) ยังแสดงให้เห็นว่าสามารถยับยั้งกิจกรรมการยับยั้งการเจริญเติบโตของ SLR1 ในขณะที่ลดการสลายตัวที่เกิดจาก GA เพียงเล็กน้อย คล้ายกับ mRGA23 ที่น่าสังเกตคือ การศึกษาล่าสุดใน Arabidopsis แสดงให้เห็นว่าการกลายพันธุ์ของกรดอะมิโนเพียงตัวเดียวในโดเมน PFYRE (S474L) เปลี่ยนแปลงกิจกรรมการถอดรหัสของ RGA โดยไม่ส่งผลกระทบต่อความสามารถในการโต้ตอบกับพันธมิตรปัจจัยการถอดรหัส50 แม้ว่าการกลายพันธุ์นี้จะใกล้เคียงกับการแทนที่กรดอะมิโน 3 ตัวที่มีอยู่ใน mRGA มาก แต่การศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่าการกลายพันธุ์ทั้งสองนี้เปลี่ยนแปลงลักษณะที่แตกต่างกันของ DELLA แม้ว่าพันธมิตรของปัจจัยการถอดรหัสส่วนใหญ่จะจับกับโดเมน LHR1 และ SAW ของ DELLA26,51 แต่กรดอะมิโนที่อนุรักษ์ไว้บางส่วนในโดเมน PFYRE อาจช่วยทำให้ปฏิสัมพันธ์เหล่านี้มีเสถียรภาพมากขึ้น
การพัฒนาปล้องเป็นลักษณะสำคัญในโครงสร้างของพืชและการปรับปรุงผลผลิต qmRGA เผยให้เห็นกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ที่สูงขึ้นในเซลล์ต้นกำเนิดปล้อง IPR โดยการผสมผสานการถ่ายภาพเชิงปริมาณและพันธุศาสตร์ เราแสดงให้เห็นว่ารูปแบบการส่งสัญญาณ GA ซ้อนทับระนาบการแบ่งเซลล์แบบวงกลม/ตามขวางในชั้นหนังกำพร้า SAM ซึ่งเป็นการกำหนดโครงสร้างการแบ่งเซลล์ที่จำเป็นสำหรับการพัฒนาปล้อง มีการระบุตัวควบคุมการวางแนวระนาบการแบ่งเซลล์หลายตัวในระหว่างการพัฒนา52,53 งานของเราให้ตัวอย่างที่ชัดเจนว่ากิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ควบคุมพารามิเตอร์ของเซลล์นี้ได้อย่างไร DELLA สามารถโต้ตอบกับโปรตีนคอมเพล็กซ์ก่อนการพับตัว41 ดังนั้นการส่งสัญญาณ GA อาจควบคุมการวางแนวระนาบการแบ่งเซลล์โดยการมีอิทธิพลโดยตรงต่อการวางแนวไมโครทิวบูลของคอร์เทกซ์40,41,54,55 เราแสดงให้เห็นโดยไม่คาดคิดว่าใน SAM ความสัมพันธ์ของกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ที่สูงขึ้นไม่ใช่การยืดตัวหรือการแบ่งเซลล์ แต่เป็นเพียงความไม่สมมาตรของการเจริญเติบโต ซึ่งสอดคล้องกับผลโดยตรงของ GA ต่อทิศทางการแบ่งเซลล์ใน IPR อย่างไรก็ตาม เราไม่สามารถตัดความเป็นไปได้ที่ผลกระทบนี้อาจเป็นผลกระทบทางอ้อมได้ เช่น ผ่านการอ่อนตัวของผนังเซลล์ที่เกิดจาก GA56 การเปลี่ยนแปลงคุณสมบัติของผนังเซลล์ทำให้เกิดความเครียดทางกล57,58 ซึ่งสามารถส่งผลต่อการวางแนวของระนาบการแบ่งเซลล์โดยส่งผลต่อการวางแนวของไมโครทิวบูลในคอร์เทกซ์39,46,59 ผลกระทบร่วมกันของความเครียดทางกลที่เกิดจาก GA และการควบคุมการวางแนวของไมโครทิวบูลโดยตรงโดย GA อาจเกี่ยวข้องกับการสร้างรูปแบบเฉพาะของการวางแนวการแบ่งเซลล์ใน IPR เพื่อกำหนดปล้อง และจำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อทดสอบแนวคิดนี้ ในทำนองเดียวกัน การศึกษาก่อนหน้านี้ได้เน้นย้ำถึงความสำคัญของโปรตีนที่โต้ตอบกับ DELLA คือ TCP14 และ 15 ในการควบคุมการสร้างปล้อง60,61 และปัจจัยเหล่านี้อาจเป็นตัวกลางในการทำงานของ GA ร่วมกับ BREVIPEDICELLUS (BP) และ PENNYWISE (PNY) ซึ่งควบคุมการพัฒนาของปล้องและแสดงให้เห็นว่ามีอิทธิพลต่อการส่งสัญญาณของ GA2,62 เนื่องจาก DELLA มีปฏิสัมพันธ์กับเส้นทางการส่งสัญญาณของบราสซิโนสเตียรอยด์ เอทิลีน กรดจัสมอนิก และกรดแอบซิสิก (ABA)63,64 และฮอร์โมนเหล่านี้สามารถส่งผลต่อการวางแนวของไมโครทูบูลได้65 ผลกระทบของ GA ต่อการวางแนวการแบ่งเซลล์อาจได้รับอิทธิพลจากฮอร์โมนอื่นๆ ด้วยเช่นกัน
การศึกษาทางด้านเซลล์วิทยาในระยะแรกแสดงให้เห็นว่าทั้งบริเวณด้านในและด้านนอกของ SAM ใน Arabidopsis มีความจำเป็นต่อการพัฒนาปล้อง2,42 ข้อเท็จจริงที่ว่า GA ควบคุมการแบ่งเซลล์ในเนื้อเยื่อด้านในอย่างแข็งขัน12 สนับสนุนหน้าที่สองประการของ GA ในการควบคุมขนาดของเนื้อเยื่อเจริญและปล้องใน SAM รูปแบบของการแบ่งเซลล์แบบมีทิศทางยังได้รับการควบคุมอย่างเข้มงวดในเนื้อเยื่อ SAM ด้านใน และการควบคุมนี้มีความสำคัญต่อการเจริญเติบโตของลำต้น52 จึงน่าสนใจที่จะตรวจสอบว่า GA มีบทบาทในการกำหนดทิศทางของระนาบการแบ่งเซลล์ในโครงสร้าง SAM ด้านในหรือไม่ ซึ่งจะช่วยประสานการกำหนดและการพัฒนาของปล้องภายใน SAM
พืชถูกเพาะเลี้ยงในหลอดทดลองในดินหรือในอาหารเลี้ยงเชื้อ Murashige-Skoog (MS) ความเข้มข้น 1x (Duchefa) เสริมด้วยซูโครส 1% และอะการ์ 1% (Sigma) ภายใต้สภาวะมาตรฐาน (แสง 16 ชั่วโมง อุณหภูมิ 22 °C) ยกเว้นการทดลองการเจริญเติบโตของไฮโปโคทิลและราก ซึ่งต้นกล้าถูกเพาะเลี้ยงบนจานแนวตั้งภายใต้แสงคงที่และอุณหภูมิ 22 °C สำหรับการทดลองเกี่ยวกับไนเตรต พืชถูกเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ MS ที่ดัดแปลงแล้ว (อาหารเลี้ยงเชื้อ bioWORLD) เสริมด้วยไนเตรตในปริมาณที่เหมาะสม (0 หรือ 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-succinate, ซูโครส 1% และ A-agar 1% (Sigma) ภายใต้สภาวะแสงยาว
นำ cDNA ของ GID1a ที่แทรกเข้าไปใน pDONR221 มาทำการรวมตัวใหม่กับ pDONR P4-P1R-pUBQ10 และ pDONR P2R-P3-mCherry เข้าไปใน pB7m34GW เพื่อสร้าง pUBQ10::GID1a-mCherry และนำ DNA ของ IDD2 ที่แทรกเข้าไปใน pDONR221 มาทำการรวมตัวใหม่กับ pB7RWG266 เพื่อสร้าง p35S:IDD2-RFP ในการสร้าง pGID1b::2xmTQ2-GID1b นั้น ขั้นแรกจะทำการขยายส่วนของดีเอ็นเอขนาด 3.9 กิโลเบสที่อยู่เหนือบริเวณรหัสของ GID1b และส่วนของดีเอ็นเอขนาด 4.7 กิโลเบสที่มี cDNA ของ GID1b (1.3 กิโลเบส) และเทอร์มิเนเตอร์ (3.4 กิโลเบส) โดยใช้ไพรเมอร์ในตารางเสริม 3 จากนั้นจึงนำไปแทรกใน pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) และ pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) ตามลำดับ และสุดท้ายนำไปรวมกับ pDONR221 2xmTQ268 เข้าไปในเวกเตอร์เป้าหมาย pGreen 012567 โดยใช้เทคนิค Gateway cloning ในการสร้าง pCUC2::LSSmOrange นั้น ลำดับโปรโมเตอร์ CUC2 (3229 bp เหนือ ATG) ตามด้วยลำดับการเข้ารหัสของ large Stokes-shifted mOrange (LSSmOrange)69 พร้อมด้วยสัญญาณระบุตำแหน่งนิวเคลียส N7 และตัวยุติการถอดรหัส NOS ถูกประกอบเข้ากับเวกเตอร์เป้าหมาย pGreen kanamycin โดยใช้ระบบการรวมตัวแบบ 3 ชิ้นส่วน Gateway (Invitrogen) เวกเตอร์ไบนารีของพืชถูกนำเข้าสู่ Agrobacterium tumefaciens สายพันธุ์ GV3101 และนำเข้าสู่ใบ Nicotiana benthamiana โดยวิธีการแทรกซึมของ Agrobacterium และเข้าสู่ Arabidopsis thaliana Col-0 โดยวิธีการจุ่มดอก ตามลำดับ pUBQ10::qmRGA, pUBQ10::GID1a-mCherry และ pCLV3::mCherry-NLS qmRGA ถูกแยกได้จากลูกหลาน F3 และ F1 ของการผสมข้ามพันธุ์ตามลำดับ
การไฮบริดไดเซชันของ RNA ในแหล่งกำเนิด (RNA in situ hybridization) ดำเนินการกับปลายยอดที่มีความยาวประมาณ 1 ซม.72 ซึ่งเก็บรวบรวมและตรึงทันทีในสารละลาย FAA (ฟอร์มาลดีไฮด์ 3.7%, กรดอะซิติก 5%, เอทานอล 50%) ที่แช่เย็นไว้ที่ 4 °C หลังจากการบำบัดด้วยสุญญากาศ 2 ครั้ง ครั้งละ 15 นาที สารตรึงจะถูกเปลี่ยนและตัวอย่างจะถูกบ่มข้ามคืน cDNA ของ GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 และ RGL3 และโพรบแอนติเซนส์สำหรับ 3′-UTR ของพวกมันถูกสังเคราะห์โดยใช้ไพรเมอร์ที่แสดงในตารางเสริม 3 ตามที่อธิบายโดย Rosier et al.73 โพรบที่ติดฉลากด้วยไดจอกซิเจนินถูกตรวจจับด้วยวิธีอิมมูโนดีเทคชันโดยใช้แอนติบอดีไดจอกซิเจนิน (เจือจาง 3000 เท่า; Roche, หมายเลขแคตตาล็อก: 11 093 274 910) และส่วนตัดถูกย้อมด้วยสารละลาย 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP, เจือจาง 250 เท่า)/nitroblue tetrazolium (NBT, เจือจาง 200 เท่า)