ไบโอเซนเซอร์จิบเบอเรลลินเชิงปริมาณเผยให้เห็นบทบาทของจิบเบอเรลลินในการกำหนดลักษณะปล้องในเนื้อเยื่อเจริญปลายยอด

การเจริญเติบโตของเนื้อเยื่อเจริญปลายยอด (SAM) มีความสำคัญต่อโครงสร้างลำต้น ฮอร์โมนพืชจิบเบอเรลลิน(GA) มีบทบาทสำคัญในการประสานงานการเจริญเติบโตของพืช แต่บทบาทของ GA ใน SAM ยังคงไม่ค่อยเข้าใจ ในที่นี้ เราได้พัฒนาไบโอเซนเซอร์แบบอัตราส่วนของการส่งสัญญาณ GA โดยออกแบบโปรตีน DELLA เพื่อระงับการทำงานควบคุมที่จำเป็นในการตอบสนองการถอดรหัสของ GA ในขณะที่รักษาการสลายตัวของโปรตีนไว้เมื่อมีการจดจำ GA เราแสดงให้เห็นว่าไบโอเซนเซอร์ที่อาศัยการสลายตัวนี้บันทึกการเปลี่ยนแปลงในระดับ GA และการรับรู้ของเซลล์ในระหว่างการพัฒนาได้อย่างแม่นยำ เราใช้ไบโอเซนเซอร์นี้เพื่อทำแผนที่กิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ใน SAM เราแสดงให้เห็นว่าสัญญาณ GA สูงมีอยู่ส่วนใหญ่ในเซลล์ที่อยู่ระหว่างเนื้อเยื่ออวัยวะ ซึ่งเป็นสารตั้งต้นของเซลล์ปล้อง โดยใช้แนวทางการเพิ่มและการสูญเสียฟังก์ชัน เราแสดงให้เห็นเพิ่มเติมว่า GA ควบคุมการวางแนวของระนาบการแบ่งเซลล์ โดยสร้างการจัดระเบียบของเซลล์ปล้องตามแบบแผน จึงส่งเสริมการกำหนดปล้องใน SAM
เนื้อเยื่อเจริญปลายยอด (SAM) ซึ่งอยู่ที่ปลายยอด ประกอบด้วยช่องว่างของเซลล์ต้นกำเนิดซึ่งกิจกรรมของเซลล์เหล่านี้จะสร้างอวัยวะด้านข้างและต่อมลำต้นในลักษณะโมดูลาร์และวนซ้ำไปซ้ำมาตลอดชีวิตของพืช หน่วยซ้ำเหล่านี้หรือต่อมของพืชประกอบด้วยปล้องและอวัยวะด้านข้างที่ข้อ และเนื้อเยื่อเจริญรักแร้ในซอกใบ1 การเจริญเติบโตและการจัดระเบียบของต่อมพืชจะเปลี่ยนแปลงไปในระหว่างการพัฒนา ใน Arabidopsis การเจริญเติบโตของปล้องจะถูกระงับในระหว่างระยะการเจริญเติบโต และเนื้อเยื่อเจริญรักแร้จะยังคงอยู่ในซอกใบ ในช่วงการเปลี่ยนผ่านสู่ระยะออกดอก SAM จะกลายเป็นเนื้อเยื่อเจริญของช่อดอก โดยสร้างปล้องและตุ่มรักแร้ที่ยาวขึ้น กิ่งก้านในซอกใบ และต่อมาคือดอกไม้ที่ไม่มีใบ2 แม้ว่าเราจะมีความคืบหน้าอย่างมากในการทำความเข้าใจกลไกที่ควบคุมการเริ่มต้นของใบ ดอก และกิ่งก้าน แต่เรายังมีความรู้ค่อนข้างน้อยว่าปล้องเกิดขึ้นได้อย่างไร
การทำความเข้าใจการกระจายตัวของ GA ในเชิงปริภูมิและเวลาจะช่วยให้เข้าใจหน้าที่ของฮอร์โมนเหล่านี้ในเนื้อเยื่อต่างๆ และในระยะพัฒนาการต่างๆ ได้ดีขึ้น การแสดงภาพการสลายตัวของฟิวชัน RGA-GFP ที่แสดงออกภายใต้การกระทำของโปรโมเตอร์ของมันเองนั้นให้ข้อมูลที่สำคัญเกี่ยวกับการควบคุมระดับ GA ทั้งหมดในราก15,16 อย่างไรก็ตาม การแสดงออกของ RGA จะแตกต่างกันไปในแต่ละเนื้อเยื่อ17 และถูกควบคุมโดย GA18 ดังนั้น การแสดงออกที่แตกต่างกันของโปรโมเตอร์ RGA อาจส่งผลให้เกิดรูปแบบการเรืองแสงที่สังเกตได้ใน RGA-GFP ดังนั้นวิธีนี้จึงไม่ใช่เชิงปริมาณ เมื่อไม่นานมานี้ GA19,20 ที่มีฉลากฟลูออเรสซีน (Fl) ที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพได้เผยให้เห็นการสะสมของ GA ในเอ็นโดคอร์เทกซ์ของรากและการควบคุมระดับเซลล์โดยการขนส่ง GA เมื่อไม่นานมานี้ เซ็นเซอร์ FRET ของ GA nlsGPS1 แสดงให้เห็นว่าระดับ GA มีความสัมพันธ์กับการยืดตัวของเซลล์ในราก เส้นใย และไฮโปโคทิลที่เติบโตในสีเข้ม21 อย่างไรก็ตาม ตามที่เราได้เห็น ความเข้มข้นของ GA ไม่ใช่พารามิเตอร์เดียวที่ควบคุมกิจกรรมการส่งสัญญาณของ GA เนื่องจากขึ้นอยู่กับกระบวนการตรวจจับที่ซับซ้อน ในที่นี้ โดยอาศัยความเข้าใจของเราเกี่ยวกับเส้นทางการส่งสัญญาณของ DELLA และ GA เราได้รายงานการพัฒนาและลักษณะเฉพาะของไบโอเซนเซอร์แบบอัตราส่วนที่อาศัยการย่อยสลายสำหรับการส่งสัญญาณของ GA เพื่อพัฒนาไบโอเซนเซอร์เชิงปริมาณนี้ เราใช้ RGA ที่ไวต่อ GA ที่กลายพันธุ์ซึ่งหลอมรวมกับโปรตีนเรืองแสงและแสดงออกอย่างแพร่หลายในเนื้อเยื่อ ตลอดจนโปรตีนเรืองแสงที่ไม่ไวต่อ GA เราแสดงให้เห็นว่าการหลอมรวมโปรตีน RGA ที่กลายพันธุ์ไม่รบกวนการส่งสัญญาณของ GA ภายในเมื่อมีการแสดงออกอย่างแพร่หลาย และไบโอเซนเซอร์นี้สามารถวัดกิจกรรมการส่งสัญญาณที่เกิดจากอินพุต GA และการประมวลผลสัญญาณ GA โดยอุปกรณ์ตรวจจับด้วยความละเอียดเชิงปริภูมิและเวลาสูง เราใช้ไบโอเซนเซอร์นี้เพื่อทำแผนที่การกระจายตัวของกิจกรรมการส่งสัญญาณของ GA ในเชิงปริภูมิและเวลา และวัดปริมาณว่า GA ควบคุมพฤติกรรมของเซลล์ในชั้นหนังกำพร้า SAM ได้อย่างไร เราสาธิตให้เห็นว่า GA ควบคุมการวางแนวของระนาบการแบ่งตัวของเซลล์ SAM ที่อยู่ระหว่างเนื้อเยื่อเริ่มต้นของอวัยวะ จึงกำหนดโครงสร้างเซลล์ตามแบบแผนของปล้องได้
ในที่สุด เราถามว่า qmRGA สามารถรายงานการเปลี่ยนแปลงในระดับ GA ภายในโดยใช้ไฮโปโคทิลที่กำลังเติบโตได้หรือไม่ ก่อนหน้านี้ เราได้แสดงให้เห็นว่าไนเตรตกระตุ้นการเจริญเติบโตโดยเพิ่มการสังเคราะห์ GA และในทางกลับกัน การสลายตัวของ DELLA34 ดังนั้น เราจึงสังเกตว่าความยาวของไฮโปโคทิลในต้นกล้า pUBQ10::qmRGA ที่ปลูกภายใต้แหล่งไนเตรตในปริมาณมาก (NO3− 10 mM) ยาวนานกว่าในต้นกล้าที่ปลูกภายใต้สภาวะที่ขาดไนเตรตอย่างมีนัยสำคัญ (รูปเสริม 6a) สอดคล้องกับการตอบสนองการเจริญเติบโต สัญญาณ GA จะสูงกว่าในไฮโปโคทิลของต้นกล้าที่ปลูกภายใต้สภาวะที่มี NO3− 10 mM เมื่อเทียบกับต้นกล้าที่ปลูกโดยไม่มีไนเตรต (รูปเสริม 6b, c) ดังนั้น qmRGA ยังช่วยให้สามารถติดตามการเปลี่ยนแปลงในสัญญาณ GA ที่เกิดจากการเปลี่ยนแปลงภายในในความเข้มข้นของ GA ได้อีกด้วย
เพื่อทำความเข้าใจว่ากิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ที่ตรวจพบโดย qmRGA ขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของ GA และการรับรู้ GA ตามที่คาดไว้ตามการออกแบบเซ็นเซอร์หรือไม่ เราได้วิเคราะห์การแสดงออกของตัวรับ GID1 ทั้งสามตัวในเนื้อเยื่อพืชและเนื้อเยื่อสืบพันธุ์ ในต้นกล้า สายรายงาน GID1-GUS แสดงให้เห็นว่า GID1a และ c มีการแสดงออกสูงในใบเลี้ยง (รูปที่ 3a–c) นอกจากนี้ ตัวรับทั้งสามตัวยังแสดงออกในใบ รากด้านข้าง ปลายราก (ยกเว้นหมวกรากของ GID1b) และระบบหลอดเลือด (รูปที่ 3a–c) ใน SAM ของช่อดอก เราตรวจพบสัญญาณ GUS สำหรับ GID1b และ 1c เท่านั้น (รูปเสริม 7a–c) การผสมพันธุ์แบบอินซิทูยืนยันรูปแบบการแสดงออกเหล่านี้และแสดงให้เห็นเพิ่มเติมว่า GID1c มีการแสดงออกอย่างสม่ำเสมอในระดับต่ำใน SAM ในขณะที่ GID1b แสดงการแสดงออกที่สูงกว่าที่ขอบของ SAM (รูปเสริม 7d–l) การรวมตัวแปล pGID1b::2xmTQ2-GID1b ยังเผยให้เห็นช่วงการแสดงออกของ GID1b ที่ค่อยเป็นค่อยไป ตั้งแต่การแสดงออกต่ำหรือไม่มีเลยที่บริเวณกึ่งกลางของ SAM ไปจนถึงการแสดงออกสูงที่บริเวณขอบอวัยวะ (รูปเสริม 7m) ดังนั้น ตัวรับ GID1 จึงไม่กระจายอย่างสม่ำเสมอในและภายในเนื้อเยื่อ ในการทดลองในเวลาต่อมา เรายังสังเกตเห็นว่าการแสดงออกมากเกินไปของ GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) เพิ่มความไวของ qmRGA ในไฮโปโคทิลต่อการใช้ GA ภายนอก (รูปที่ 3d, e) ในทางตรงกันข้าม การเรืองแสงที่วัดโดย qd17mRGA ในไฮโปโคทิลไม่ไวต่อการรักษาด้วย GA3 (รูปที่ 3f, g) สำหรับการทดสอบทั้งสองแบบ ต้นกล้าได้รับการบำบัดด้วย GA ความเข้มข้นสูง (GA3 100 μM) เพื่อประเมินพฤติกรรมที่รวดเร็วของเซ็นเซอร์ ซึ่งความสามารถในการจับกับตัวรับ GID1 จะเพิ่มขึ้นหรือสูญเสียไป ผลลัพธ์เหล่านี้ร่วมกันยืนยันว่าไบโอเซนเซอร์ qmRGA ทำหน้าที่ร่วมกันเป็นเซนเซอร์ GA และ GA และชี้ให้เห็นว่าการแสดงออกที่แตกต่างกันของตัวรับ GID1 สามารถปรับเปลี่ยนการแผ่รังสีของเซนเซอร์ได้อย่างมีนัยสำคัญ
จนถึงปัจจุบัน การกระจายของสัญญาณ GA ใน SAM ยังคงไม่ชัดเจน ดังนั้น เราจึงใช้พืชที่แสดง qmRGA และตัวรายงานเซลล์ต้นกำเนิด pCLV3::mCherry-NLS35 เพื่อคำนวณแผนที่เชิงปริมาณความละเอียดสูงของกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA โดยเน้นที่ชั้น L1 (หนังกำพร้า รูปที่ 4a, b ดูวิธีการและวิธีการเสริม) เนื่องจาก L1 มีบทบาทสำคัญในการควบคุมการเติบโตของ SAM36 ที่นี่ การแสดงออกของ pCLV3::mCherry-NLS ให้จุดอ้างอิงทางเรขาคณิตคงที่สำหรับการวิเคราะห์การกระจายเชิงปริภูมิและเวลาของกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA37 แม้ว่า GA จะถือว่าจำเป็นต่อการพัฒนาอวัยวะด้านข้าง4 แต่เราสังเกตว่าสัญญาณ GA ต่ำในปฐมภูมิของดอกไม้ (P) เริ่มตั้งแต่ระยะ P3 (รูปที่ 4a, b) ในขณะที่ปฐมภูมิ P1 และ P2 อายุน้อยมีกิจกรรมปานกลางที่คล้ายกับในบริเวณส่วนกลาง (รูปที่ 4a, b) ตรวจพบกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ที่สูงขึ้นที่ขอบเขตของอวัยวะเริ่มต้นที่ P1/P2 (ที่ด้านข้างของขอบเขต) และสูงสุดที่ P4 เช่นเดียวกับในเซลล์ทั้งหมดของบริเวณรอบนอกที่อยู่ระหว่างอวัยวะเริ่มต้น (รูปที่ 4a, b และรูปที่เสริม 8a, b) กิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ที่สูงขึ้นนี้สังเกตได้ไม่เพียงแต่ในชั้นหนังกำพร้าเท่านั้น แต่ยังพบในชั้น L2 และ L3 ด้านบนด้วย (รูปที่เสริม 8b) รูปแบบของสัญญาณ GA ที่ตรวจพบใน SAM โดยใช้ qmRGA ยังคงไม่เปลี่ยนแปลงเมื่อเวลาผ่านไป (รูปที่เสริม 8c–f, k) แม้ว่าโครงสร้าง qd17mRGA จะถูกควบคุมลงอย่างเป็นระบบใน SAM ของพืช T3 จากสายพันธุ์อิสระ 5 สายพันธุ์ที่เรากำหนดลักษณะอย่างละเอียด แต่เราสามารถวิเคราะห์รูปแบบการเรืองแสงที่ได้จากโครงสร้าง pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP ได้ (รูปที่เสริม 8g–j, l) ในสายควบคุมนี้ ตรวจพบการเปลี่ยนแปลงเล็กน้อยในอัตราส่วนการเรืองแสงใน SAM แต่ในศูนย์ SAM เราสังเกตเห็นการลดลงอย่างชัดเจนและไม่คาดคิดใน VENUS ที่เกี่ยวข้องกับ TagBFP ซึ่งยืนยันว่ารูปแบบการส่งสัญญาณที่สังเกตโดย qmRGA สะท้อนถึงการเสื่อมสภาพที่ขึ้นอยู่กับ GA ของ mRGA-VENUS แต่ยังแสดงให้เห็นอีกด้วยว่า qmRGA อาจประเมินกิจกรรมการส่งสัญญาณของ GA ในศูนย์เมริสเต็มเกินจริง โดยสรุปแล้ว ผลลัพธ์ของเราเผยให้เห็นรูปแบบการส่งสัญญาณของ GA ที่สะท้อนถึงการกระจายของปริภูมิเป็นหลัก การกระจายของบริเวณระหว่างปริภูมิ (IPR) นี้เกิดจากการสร้างกิจกรรมการส่งสัญญาณของ GA ในปริมาณสูงอย่างค่อยเป็นค่อยไประหว่างปริภูมิที่กำลังพัฒนาและบริเวณส่วนกลาง ในขณะเดียวกัน กิจกรรมการส่งสัญญาณของ GA ในปริภูมิก็ลดลง (รูปที่ 4c, d)
การกระจายตัวของตัวรับ GID1b และ GID1c (ดูด้านบน) แสดงให้เห็นว่าการแสดงออกที่แตกต่างกันของตัวรับ GA ช่วยกำหนดรูปแบบของกิจกรรมการส่งสัญญาณของ GA ใน SAM เราสงสัยว่าการสะสมที่แตกต่างกันของ GA อาจมีส่วนเกี่ยวข้องหรือไม่ เพื่อตรวจสอบความเป็นไปได้นี้ เราใช้เซนเซอร์ GA FRET ของ nlsGPS121 ตรวจพบความถี่ในการเปิดใช้งานที่เพิ่มขึ้นใน SAM ของ nlsGPS1 ที่ได้รับการบำบัดด้วย GA4+7 10 μM เป็นเวลา 100 นาที (รูปเสริม 9a–e) ซึ่งบ่งชี้ว่า nlsGPS1 ตอบสนองต่อการเปลี่ยนแปลงในความเข้มข้นของ GA ใน SAM เช่นเดียวกับในราก21 การกระจายตัวเชิงพื้นที่ของความถี่ในการเปิดใช้งานของ nlsGPS1 เผยให้เห็นระดับ GA ที่ค่อนข้างต่ำในชั้นนอกของ SAM แต่แสดงให้เห็นว่าระดับดังกล่าวสูงขึ้นที่บริเวณตรงกลางและบริเวณขอบของ SAM (รูปที่ 4e และรูปเสริม 9a,c) สิ่งนี้แสดงให้เห็นว่า GA ยังกระจายอยู่ใน SAM ด้วยรูปแบบเชิงพื้นที่ที่เทียบเคียงได้กับที่เปิดเผยโดย qmRGA ในฐานะแนวทางเสริม เราได้ปฏิบัติต่อ SAM ด้วย GA เรืองแสง (GA3-, GA4-, GA7-Fl) หรือ Fl เพียงอย่างเดียวเป็นตัวควบคุมเชิงลบ สัญญาณ Fl กระจายไปทั่ว SAM รวมถึงบริเวณส่วนกลางและปฐมภูมิ แม้ว่าจะมีความเข้มต่ำกว่า (รูปที่ 4j และรูปเสริม 10d) ในทางตรงกันข้าม GA-Fl ทั้งสามตัวสะสมเฉพาะภายในขอบเขตปฐมภูมิและในระดับที่แตกต่างกันในส่วนที่เหลือของ IPR โดย GA7-Fl สะสมในโดเมนที่ใหญ่ที่สุดใน IPR (รูปที่ 4k และรูปเสริม 10a,b) การวัดปริมาณความเข้มของฟลูออเรสเซนต์เผยให้เห็นว่าอัตราส่วนความเข้มของ IPR ต่อความเข้มที่ไม่ใช่ IPR นั้นสูงกว่าใน SAM ที่ได้รับการบำบัดด้วย GA-Fl เมื่อเทียบกับ SAM ที่ได้รับการบำบัดด้วย Fl (รูปที่ 4l และรูปเสริม 10c) เมื่อนำผลลัพธ์เหล่านี้มารวมกัน แสดงให้เห็นว่า GA มีอยู่ในความเข้มข้นที่สูงขึ้นในเซลล์ IPR ที่อยู่ใกล้กับขอบอวัยวะมากที่สุด ซึ่งแสดงให้เห็นว่ารูปแบบของกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ของ SAM เป็นผลมาจากการแสดงออกของตัวรับ GA ที่แตกต่างกันและการสะสม GA ที่แตกต่างกันในเซลล์ IPR ใกล้กับขอบอวัยวะ ดังนั้น การวิเคราะห์ของเราจึงเผยให้เห็นรูปแบบการส่งสัญญาณ GA ทั้งในเชิงปริภูมิและเวลาโดยไม่คาดคิด โดยมีกิจกรรมที่ลดลงในศูนย์กลางและปริภูมิปฐมภูมิของ SAM และมีกิจกรรมที่สูงกว่าใน IPR ในบริเวณรอบนอก
เพื่อทำความเข้าใจบทบาทของกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ที่แตกต่างกันใน SAM เราได้วิเคราะห์ความสัมพันธ์ระหว่างกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA การขยายตัวของเซลล์ และการแบ่งเซลล์โดยใช้การถ่ายภาพแบบไทม์แลปส์แบบเรียลไทม์ของ SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS เมื่อพิจารณาถึงบทบาทของ GA ในการควบคุมการเจริญเติบโต คาดว่าจะมีความสัมพันธ์เชิงบวกกับพารามิเตอร์การขยายตัวของเซลล์ ดังนั้น เราจึงเปรียบเทียบแผนที่กิจกรรมการส่งสัญญาณ GA กับแผนที่อัตราการเจริญเติบโตบนพื้นผิวเซลล์ (ซึ่งเป็นตัวแทนของความแรงของการขยายตัวของเซลล์สำหรับเซลล์ที่กำหนดและสำหรับเซลล์ลูกเมื่อแบ่งตัว) และกับแผนที่แอนไอโซทรอปิกของการเจริญเติบโต ซึ่งวัดทิศทางของการขยายตัวของเซลล์ (ซึ่งใช้สำหรับเซลล์ที่กำหนดและสำหรับเซลล์ลูกเมื่อแบ่งตัวด้วย รูปที่ 5a,b ดูวิธีการและวิธีการเสริม) แผนที่อัตราการเจริญเติบโตบนพื้นผิวเซลล์ SAM ของเราสอดคล้องกับการสังเกตก่อนหน้านี้38,39 โดยมีอัตราการเติบโตขั้นต่ำที่ขอบและอัตราการเติบโตสูงสุดในดอกไม้ที่กำลังพัฒนา (รูปที่ 5a) การวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก (PCA) แสดงให้เห็นว่ากิจกรรมการส่งสัญญาณของ GA มีความสัมพันธ์เชิงลบกับความเข้มข้นของการเจริญเติบโตบนพื้นผิวเซลล์ (รูปที่ 5c) นอกจากนี้ เรายังแสดงให้เห็นด้วยว่าแกนหลักของการเปลี่ยนแปลง ซึ่งรวมถึงอินพุตการส่งสัญญาณของ GA และความเข้มข้นของการเจริญเติบโต ตั้งฉากกับทิศทางที่กำหนดโดยการแสดงออกของ CLV3 สูง ซึ่งยืนยันการแยกเซลล์ออกจากศูนย์กลาง SAM ในการวิเคราะห์ที่เหลือ การวิเคราะห์ความสัมพันธ์ของสเปียร์แมนยืนยันผลลัพธ์ PCA (รูปที่ 5d) ซึ่งระบุว่าสัญญาณ GA ที่สูงขึ้นใน IPR ไม่ได้ส่งผลให้เซลล์ขยายตัวมากขึ้น อย่างไรก็ตาม การวิเคราะห์ความสัมพันธ์เผยให้เห็นความสัมพันธ์เชิงบวกเล็กน้อยระหว่างกิจกรรมการส่งสัญญาณของ GA และแอนไอโซทรอปีของการเจริญเติบโต (รูปที่ 5c, d) ซึ่งบ่งชี้ว่าการส่งสัญญาณ GA ที่สูงขึ้นใน IPR มีอิทธิพลต่อทิศทางการเติบโตของเซลล์และอาจส่งผลต่อตำแหน่งของระนาบการแบ่งเซลล์ด้วย
a, b แผนที่ความร้อนของการเจริญเติบโตบนพื้นผิวเฉลี่ย (a) และการเจริญเติบโตแบบแอนไอโซทรอปิก (b) ใน SAM เฉลี่ยจากพืชอิสระ 7 ต้น (ใช้เป็นตัวแทนสำหรับความแรงและทิศทางของการขยายตัวของเซลล์ตามลำดับ) c การวิเคราะห์ PCA ประกอบด้วยตัวแปรต่อไปนี้: สัญญาณ GA ความเข้มของการเจริญเติบโตบนพื้นผิว แอนไอโซทรอปิกของการเจริญเติบโตบนพื้นผิว และการแสดงออกของ CLV3 ส่วนประกอบ PCA 1 มีความสัมพันธ์เชิงลบเป็นหลักกับความเข้มของการเจริญเติบโตบนพื้นผิว และมีความสัมพันธ์เชิงบวกกับสัญญาณ GA ส่วนประกอบ PCA 2 มีความสัมพันธ์เชิงบวกเป็นหลักกับแอนไอโซทรอปิกของการเจริญเติบโตบนพื้นผิว และมีความสัมพันธ์เชิงลบกับการแสดงออกของ CLV3 เปอร์เซ็นต์แสดงถึงความแปรผันที่อธิบายโดยส่วนประกอบแต่ละส่วน d การวิเคราะห์ความสัมพันธ์แบบสเปียร์แมนระหว่างสัญญาณ GA ความเข้มของการเจริญเติบโตบนพื้นผิว และแอนไอโซทรอปิกของการเจริญเติบโตบนพื้นผิวในระดับเนื้อเยื่อ ไม่รวม CZ ตัวเลขทางด้านขวาคือค่าโรสเปียร์แมนระหว่างตัวแปรสองตัว เครื่องหมายดอกจันระบุกรณีที่ความสัมพันธ์/ความสัมพันธ์เชิงลบมีความสำคัญอย่างยิ่ง e การสร้างภาพสามมิติของเซลล์ Col-0 SAM L1 โดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคัล ผนังเซลล์ใหม่ที่เกิดขึ้นใน SAM (แต่ไม่ใช่เซลล์ต้นกำเนิด) ที่เวลา 10 ชั่วโมง จะถูกระบายสีตามค่ามุม แถบสีจะแสดงอยู่ที่มุมขวาล่าง ภาพขยายแสดงภาพสามมิติที่สอดคล้องกันที่เวลา 0 ชั่วโมง การทดลองซ้ำสองครั้งโดยได้ผลลัพธ์ที่คล้ายกัน กราฟกล่องแสดงอัตราการแบ่งเซลล์ใน SAM Col-0 IPR และที่ไม่ใช่ IPR (n = 10 ต้นอิสระ) เส้นกึ่งกลางแสดงค่ามัธยฐาน และขอบกล่องแสดงเปอร์เซ็นต์ที่ 25 และ 75 หนวดแสดงค่าต่ำสุดและค่าสูงสุดที่กำหนดโดยซอฟต์แวร์ R ค่า P ได้มาจากการทดสอบ t สองหางของ Welch g, h แผนภาพแสดง (g) วิธีวัดมุมของผนังเซลล์ใหม่ (สีแดงอมม่วง) เทียบกับทิศทางรัศมีจากจุดศูนย์กลางของ SAM (เส้นประสีขาว) (พิจารณาเฉพาะค่ามุมแหลม เช่น 0–90°) และ (h) ทิศทางเส้นรอบวง/ด้านข้างและรัศมีภายในเนื้อเยื่อเจริญ i ฮิสโทแกรมความถี่ของการวางแนวระนาบการแบ่งเซลล์ข้าม SAM (สีน้ำเงินเข้ม) IPR (สีน้ำเงินปานกลาง) และไม่ใช่ IPR (สีน้ำเงินอ่อน) ตามลำดับ ค่า P ได้มาจากการทดสอบ Kolmogorov-Smirnov สองหาง การทดลองซ้ำสองครั้งด้วยผลลัพธ์ที่คล้ายกัน j ฮิสโทแกรมความถี่ของการวางแนวระนาบการแบ่งเซลล์ของ IPR รอบ P3 (สีเขียวอ่อน) P4 (สีเขียวปานกลาง) และ P5 (สีเขียวเข้ม) ตามลำดับ ค่า P ได้มาจากการทดสอบ Kolmogorov-Smirnov สองหาง การทดลองซ้ำสองครั้งด้วยผลลัพธ์ที่คล้ายกัน
ดังนั้น เราจึงตรวจสอบความสัมพันธ์ระหว่างการส่งสัญญาณ GA และกิจกรรมการแบ่งเซลล์ต่อไปโดยระบุผนังเซลล์ที่เพิ่งก่อตัวขึ้นใหม่ระหว่างการทดสอบ (รูปที่ 5e) วิธีนี้ทำให้เราสามารถวัดความถี่และทิศทางของการแบ่งเซลล์ได้ ที่น่าประหลาดใจคือ เราพบว่าความถี่ของการแบ่งเซลล์ใน IPR และ SAM ที่เหลือ (ไม่ใช่ IPR รูปที่ 5f) มีความคล้ายคลึงกัน ซึ่งบ่งชี้ว่าความแตกต่างในการส่งสัญญาณ GA ระหว่างเซลล์ IPR และเซลล์ที่ไม่ใช่ IPR ไม่มีผลต่อการแบ่งเซลล์อย่างมีนัยสำคัญ สิ่งนี้และความสัมพันธ์เชิงบวกระหว่างการส่งสัญญาณ GA กับการเจริญเติบโตแบบแอนไอโซทรอปิก กระตุ้นให้เราพิจารณาว่ากิจกรรมการส่งสัญญาณ GA สามารถส่งผลต่อการวางแนวของระนาบการแบ่งเซลล์ได้หรือไม่ เราได้วัดทิศทางของผนังเซลล์ใหม่เป็นมุมแหลมเทียบกับแกนรัศมีที่เชื่อมระหว่างศูนย์กลางของเนื้อเยื่อเจริญและศูนย์กลางของผนังเซลล์ใหม่ (รูปที่ 5e-i) และสังเกตเห็นแนวโน้มที่ชัดเจนของเซลล์ที่จะแบ่งตัวในมุมที่ใกล้เคียงกับ 90° เทียบกับแกนรัศมี โดยพบความถี่สูงสุดที่ 70–80° (23.28%) และ 80–90° (22.62%) (รูปที่ 5e,i) ซึ่งสอดคล้องกับการแบ่งตัวของเซลล์ในทิศทางรอบวง/ตามขวาง (รูปที่ 5h) เพื่อตรวจสอบการมีส่วนสนับสนุนของการส่งสัญญาณ GA ต่อพฤติกรรมการแบ่งตัวของเซลล์นี้ เราได้วิเคราะห์พารามิเตอร์การแบ่งตัวของเซลล์ใน IPR และแบบไม่ใช่ IPR แยกกัน (รูปที่ 5i) เราสังเกตว่าการกระจายมุมการแบ่งเซลล์ในเซลล์ IPR แตกต่างจากเซลล์ที่ไม่ใช่ IPR หรือในเซลล์ใน SAM ทั้งหมด โดยเซลล์ IPR แสดงสัดส่วนของการแบ่งเซลล์ในแนวข้าง/วงกลมที่สูงกว่า นั่นคือ 70–80° และ 80–90° (33.86% และ 30.71% ตามลำดับ ซึ่งเป็นสัดส่วนที่สอดคล้องกัน) (รูปที่ 5i) ดังนั้น การสังเกตของเราจึงเผยให้เห็นความสัมพันธ์ระหว่างการส่งสัญญาณ GA สูงกับการวางแนวระนาบการแบ่งเซลล์ที่ใกล้เคียงกับทิศทางรอบวง ซึ่งคล้ายกับความสัมพันธ์ระหว่างกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA กับแอนไอโซทรอปิกของการเจริญเติบโต (รูปที่ 5c, d) เพื่อสร้างการอนุรักษ์เชิงพื้นที่ของความสัมพันธ์นี้เพิ่มเติม เราได้วัดการวางแนวระนาบการแบ่งเซลล์ในเซลล์ IPR โดยรอบปฐมภูมิโดยเริ่มจาก P3 เนื่องจากตรวจพบกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA สูงสุดในบริเวณนี้โดยเริ่มจาก P4 (รูปที่ 4) มุมการแบ่งเซลล์ของ IPR รอบ P3 และ P4 ไม่แสดงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญทางสถิติ แม้ว่าจะสังเกตเห็นความถี่ที่เพิ่มขึ้นของการแบ่งเซลล์ด้านข้างใน IPR รอบ P4 (รูปที่ 5j) อย่างไรก็ตาม ในเซลล์ IPR รอบ P5 ความแตกต่างในทิศทางของระนาบการแบ่งเซลล์กลายเป็นสิ่งที่มีนัยสำคัญทางสถิติ โดยมีความถี่ของการแบ่งเซลล์ตามขวางเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็ว (รูปที่ 5j) ผลลัพธ์เหล่านี้ร่วมกันชี้ให้เห็นว่าการส่งสัญญาณ GA สามารถควบคุมทิศทางของการแบ่งเซลล์ใน SAM ได้ ซึ่งสอดคล้องกับรายงานก่อนหน้านี้40,41 ที่ระบุว่าการส่งสัญญาณ GA สูงสามารถเหนี่ยวนำทิศทางด้านข้างของการแบ่งเซลล์ใน IPR ได้
คาดการณ์ว่าเซลล์ใน IPR จะไม่ถูกรวมเข้าในไพรมอร์เดีย แต่จะรวมเข้าในปล้อง2,42,43 การวางแนวขวางของการแบ่งเซลล์ใน IPR อาจส่งผลให้เกิดการจัดระเบียบแบบขนานตามยาวของเซลล์เยื่อบุผิวในปล้อง การสังเกตของเราที่อธิบายไว้ข้างต้นชี้ให้เห็นว่าการส่งสัญญาณ GA น่าจะมีบทบาทในกระบวนการนี้โดยควบคุมทิศทางของการแบ่งเซลล์
การสูญเสียหน้าที่ของยีน DELLA หลายยีนส่งผลให้เกิดการตอบสนองของ GA อย่างต่อเนื่อง และสามารถใช้กลายพันธุ์เดลลาเพื่อทดสอบสมมติฐานนี้ได้44 ก่อนอื่น เราได้วิเคราะห์รูปแบบการแสดงออกของยีน DELLA ห้ายีนใน SAM การหลอมรวมทางถอดรหัสของสาย GUS45 เผยให้เห็นว่า GAI, RGA, RGL1 และ RGL2 (ในระดับที่น้อยกว่ามาก) ถูกแสดงออกใน SAM (รูปเสริม 11a–d) ไฮบริดิเซชันแบบอินซิทูแสดงให้เห็นเพิ่มเติมว่า mRNA ของ GAI สะสมโดยเฉพาะในต้นอ่อนและดอกไม้ที่กำลังพัฒนา (รูปเสริม 11e) ตรวจพบ mRNA ของ RGL1 และ RGL3 ทั่วทั้งเรือนยอดของ SAM และในดอกไม้ที่แก่กว่า ในขณะที่ mRNA ของ RGL2 มีมากขึ้นในบริเวณขอบ (รูปเสริม 11f–h) การถ่ายภาพแบบคอนโฟคัลของ pRGL3::RGL3-GFP SAM ยืนยันการแสดงออกที่สังเกตได้จากการผสมพันธุ์แบบอินซิทู และแสดงให้เห็นว่าโปรตีน RGL3 สะสมในส่วนกลางของ SAM (รูปเสริม 11i) เมื่อใช้สาย pRGA::GFP-RGA เรายังพบว่าโปรตีน RGA สะสมใน SAM แต่ปริมาณจะลดลงที่ขอบเริ่มจาก P4 (รูปเสริม 11j) ที่น่าสังเกตคือ รูปแบบการแสดงออกของ RGL3 และ RGA สอดคล้องกับกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ที่สูงขึ้นใน IPR ซึ่งตรวจพบโดย qmRGA (รูปที่ 4) นอกจากนี้ ข้อมูลเหล่านี้ยังบ่งชี้ว่า DELLA ทั้งหมดมีการแสดงออกใน SAM และการแสดงออกของ DELLA เหล่านี้รวมกันครอบคลุม SAM ทั้งหมด
จากนั้นเราวิเคราะห์พารามิเตอร์การแบ่งเซลล์ใน SAM ประเภทป่า (Ler, ตัวควบคุม) และกลายพันธุ์ gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (ทั่วโลก) (รูปที่ 6a, b) ที่น่าสนใจคือ เราสังเกตเห็นการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญทางสถิติในการกระจายความถี่ของมุมการแบ่งเซลล์ใน SAM ประเภทป่า della ทั่วโลกเมื่อเทียบกับประเภทป่า (รูปที่ 6c) การเปลี่ยนแปลงนี้ในกลายพันธุ์ประเภทป่า della ทั่วโลกเกิดจากความถี่ที่เพิ่มขึ้นของมุม 80–90° (34.71% เทียบกับ 24.55%) และในระดับที่น้อยกว่าคือมุม 70–80° (23.78% เทียบกับ 20.18%) ซึ่งสอดคล้องกับการแบ่งเซลล์ตามขวาง (รูปที่ 6c) ความถี่ของการแบ่งเซลล์แบบไม่ขวาง (0–60°) ก็ต่ำกว่าในกลายพันธุ์เดลลาโกลบอลเช่นกัน (รูปที่ 6c) ความถี่ของการแบ่งเซลล์แบบขวางเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญใน SAM ของกลายพันธุ์เดลลาโกลบอล (รูปที่ 6b) ความถี่ของการแบ่งเซลล์แบบขวางใน IPR ก็สูงกว่าในกลายพันธุ์เดลลาโกลบอลเช่นกันเมื่อเทียบกับแบบไวด์ไทป์ (รูปที่ 6d) นอกบริเวณ IPR แบบไวด์ไทป์มีการกระจายมุมการแบ่งเซลล์ที่สม่ำเสมอกว่า ในขณะที่กลายพันธุ์เดลลาโกลบอลชอบการแบ่งเซลล์แบบสัมผัส เช่น แบบ IPR (รูปที่ 6e) นอกจากนี้ เรายังวัดทิศทางของการแบ่งเซลล์ใน SAM ของกลายพันธุ์ควินทูเพิลของ ga2 oxidase (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 และ ga2ox6-2) ซึ่งเป็นพื้นหลังกลายพันธุ์ที่ไม่ทำงานของ GA ซึ่ง GA จะสะสมอยู่ จากระดับ GA ที่เพิ่มขึ้น SAM ของช่อดอกกลายพันธุ์ควินทูเพิล ga2ox มีขนาดใหญ่กว่าของ Col-0 (รูปเสริม 12a, b) และเมื่อเปรียบเทียบกับ Col-0 แล้ว SAM ของควินทูเพิล ga2ox แสดงการกระจายของมุมการแบ่งเซลล์ที่แตกต่างกันอย่างชัดเจน โดยความถี่ของมุมเพิ่มขึ้นจาก 50° เป็น 90° กล่าวคือ ส่งเสริมการแบ่งเซลล์แบบสัมผัสอีกครั้ง (รูปเสริม 12a–c) ดังนั้น เราจึงแสดงให้เห็นว่าการกระตุ้นสัญญาณ GA และการสะสมของ GA อย่างต่อเนื่องจะกระตุ้นให้เกิดการแบ่งเซลล์ด้านข้างใน IPR และส่วนที่เหลือของ SAM
a, b การสร้างภาพสามมิติของชั้น L1 ของ SAM ที่ย้อมด้วย PI (a) และ della mutant ทั่วโลก (b) โดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคัล ผนังเซลล์ใหม่ที่เกิดขึ้นใน SAM (แต่ไม่ใช่ส่วนปฐมภูมิ) ในช่วงเวลา 10 ชั่วโมงจะแสดงและระบายสีตามค่ามุมของผนังเซลล์ ภาพขยายแสดง SAM ที่ 0 ชั่วโมง แถบสีจะแสดงที่มุมล่างขวา ลูกศรใน (b) ชี้ไปที่ตัวอย่างของไฟล์เซลล์ที่เรียงตัวกันใน della mutant ทั่วโลก การทดลองซ้ำสองครั้งโดยได้ผลลัพธ์ที่คล้ายกัน ce การเปรียบเทียบการกระจายความถี่ของทิศทางระนาบการแบ่งเซลล์ใน SAM ทั้งหมด (d), IPR (e) และไม่ใช่ IPR (f) ระหว่าง Ler และ della ทั่วโลก ค่า P ได้มาจากการทดสอบ Kolmogorov-Smirnov สองหาง f, g การสร้างภาพสามมิติของภาพคอนโฟคัลของ SAM ที่ย้อมด้วย PI ของพืชทรานสเจนิก Col-0 (i) และ pCUC2::gai-1-VENUS (j) แผง (a, b) แสดงผนังเซลล์ใหม่ (แต่ไม่ใช่ primordia) ที่เกิดขึ้นใน SAM ภายใน 10 ชั่วโมง การทดลองซ้ำสองครั้งโดยได้ผลลัพธ์ที่คล้ายกัน h–j การเปรียบเทียบการกระจายความถี่ของทิศทางระนาบการแบ่งเซลล์ที่อยู่ใน SAM ทั้งหมด (h), IPR (i) และที่ไม่ใช่ IPR (j) ระหว่างพืช Col-0 และ pCUC2::gai-1-VENUS ค่า P ได้มาจากการทดสอบ Kolmogorov–Smirnov แบบสองหาง
จากนั้น เราจึงทดสอบผลของการยับยั้งการส่งสัญญาณ GA โดยเฉพาะใน IPR เพื่อจุดประสงค์นี้ เราจึงใช้โปรโมเตอร์ cotyledon cup 2 (CUC2) เพื่อขับเคลื่อนการแสดงออกของโปรตีน gai-1 เชิงลบที่โดดเด่นที่หลอมรวมกับ VENUS (ในสายพันธุ์ pCUC2::gai-1-VENUS) ใน SAM ประเภทป่า โปรโมเตอร์ CUC2 ขับเคลื่อนการแสดงออกของ IPR ส่วนใหญ่ใน SAM รวมถึงเซลล์ขอบ ตั้งแต่ P4 เป็นต้นไป และพบการแสดงออกเฉพาะที่คล้ายคลึงกันในพืช pCUC2::gai-1-VENUS (ดูด้านล่าง) การกระจายของมุมการแบ่งเซลล์ทั่ว SAM หรือ IPR ของพืช pCUC2::gai-1-VENUS ไม่แตกต่างอย่างมีนัยสำคัญจากของประเภทป่า แม้ว่าเราจะพบโดยไม่คาดคิดว่าเซลล์ที่ไม่มี IPR ในพืชเหล่านี้จะแบ่งตัวที่ความถี่สูงกว่าที่ 80–90° (รูปที่ 6f–j)
มีการเสนอแนะว่าทิศทางของการแบ่งเซลล์ขึ้นอยู่กับรูปทรงเรขาคณิตของ SAM โดยเฉพาะแรงดึงที่เกิดจากความโค้งของเนื้อเยื่อ46 ดังนั้น เราจึงถามว่ารูปร่างของ SAM ถูกเปลี่ยนแปลงไปในพืชกลายพันธุ์เดลลาโกลบอลและ pCUC2::gai-1-VENUS หรือไม่ ตามที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้12 ขนาดของ SAM กลายพันธุ์เดลลาโกลบอลมีขนาดใหญ่กว่าของชนิดป่า (รูปเสริม 13a, b, d) การผสมพันธุ์แบบอินซิทูของ CLV3 และ STM RNA ยืนยันการขยายตัวของเนื้อเยื่อเจริญในกลายพันธุ์เดลลาและแสดงให้เห็นการขยายตัวด้านข้างของช่องเซลล์ต้นกำเนิดเพิ่มเติม (รูปเสริม 13e, f, h, i) อย่างไรก็ตาม ความโค้งของ SAM มีความคล้ายคลึงกันในจีโนไทป์ทั้งสอง (รูปเสริม 13k, m, n, p) เราสังเกตเห็นการเพิ่มขึ้นของขนาดที่คล้ายคลึงกันในกลายพันธุ์ gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple โดยไม่มีการเปลี่ยนแปลงในความโค้งเมื่อเทียบกับประเภทป่า (ภาพเสริม 13c, d, g, j, l, o, p) ความถี่ของทิศทางการแบ่งเซลล์ได้รับผลกระทบในกลายพันธุ์ della quadruple เช่นกัน แต่ในระดับที่น้อยกว่าในกลายพันธุ์ della monolithic (ภาพเสริม 12d–f) ผลของปริมาณนี้ ร่วมกับการขาดผลต่อความโค้ง แสดงให้เห็นว่ากิจกรรม RGL3 ที่เหลืออยู่ในกลายพันธุ์ Della quadruple จำกัดการเปลี่ยนแปลงในทิศทางการแบ่งเซลล์ที่เกิดจากการสูญเสียกิจกรรมของ DELLA และการเปลี่ยนแปลงในการแบ่งเซลล์ด้านข้างเกิดขึ้นเพื่อตอบสนองต่อการเปลี่ยนแปลงในกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA มากกว่าการเปลี่ยนแปลงในเรขาคณิตของ SAM ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น โปรโมเตอร์ CUC2 ขับเคลื่อนการแสดงออกของ IPR ใน SAM โดยเริ่มตั้งแต่ P4 (รูปเสริม 14a, b) และในทางตรงกันข้าม SAM ของ pCUC2::gai-1-VENUS มีขนาดที่เล็กลงแต่มีความโค้งที่สูงกว่า (รูปเสริม 14c–h) การเปลี่ยนแปลงในสัณฐานวิทยาของ SAM ของ pCUC2::gai-1-VENUS นี้อาจส่งผลให้มีการกระจายของความเค้นเชิงกลที่แตกต่างกันเมื่อเทียบกับประเภทป่า ซึ่งความเค้นรอบทิศทางที่สูงจะเริ่มที่ระยะทางที่สั้นกว่าจากศูนย์กลาง SAM47 หรืออีกทางหนึ่ง การเปลี่ยนแปลงในสัณฐานวิทยาของ SAM ของ pCUC2::gai-1-VENUS อาจเป็นผลมาจากการเปลี่ยนแปลงในคุณสมบัติเชิงกลของภูมิภาคที่เกิดจากการแสดงออกของทรานส์ยีน48 ในทั้งสองกรณี สิ่งนี้อาจชดเชยผลกระทบของการเปลี่ยนแปลงในการส่งสัญญาณ GA ได้บางส่วนโดยเพิ่มโอกาสที่เซลล์จะแบ่งตัวในทิศทางรอบทิศทาง/ตามขวาง ซึ่งอธิบายการสังเกตของเราได้
เมื่อนำข้อมูลทั้งหมดมารวมกันแล้ว พบว่าการส่งสัญญาณ GA ที่สูงขึ้นมีบทบาทสำคัญในการวางแนวด้านข้างของระนาบการแบ่งเซลล์ใน IPR นอกจากนี้ยังแสดงให้เห็นอีกด้วยว่าความโค้งของเนื้อเยื่อเจริญยังส่งผลต่อการวางแนวของระนาบการแบ่งเซลล์ใน IPR อีกด้วย
การวางแนวขวางของระนาบการแบ่งใน IPR เนื่องมาจากกิจกรรมการส่งสัญญาณของ GA ที่สูง แสดงให้เห็นว่า GA จัดระเบียบไฟล์เซลล์แนวรัศมีล่วงหน้าในชั้นหนังกำพร้าภายใน SAM เพื่อกำหนดโครงสร้างเซลล์ที่จะพบในภายหลังในปมของชั้นหนังกำพร้า ในความเป็นจริง ไฟล์เซลล์ดังกล่าวมักมองเห็นได้ในภาพ SAM ของเดลลาโกลบอลมิวแทนต์ (รูปที่ 6b) ดังนั้น เพื่อสำรวจหน้าที่การพัฒนาของรูปแบบเชิงพื้นที่ของการส่งสัญญาณของ GA ใน SAM เพิ่มเติม เราจึงใช้การถ่ายภาพแบบไทม์แลปส์เพื่อวิเคราะห์โครงสร้างเชิงพื้นที่ของเซลล์ใน IPR ในพืชประเภทป่า (Ler และ Col-0) เดลลาโกลบอลมิวแทนต์ และพืชทรานสเจนิก pCUC2::gai-1-VENUS
เราพบว่า qmRGA แสดงให้เห็นว่ากิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ใน IPR เพิ่มขึ้นจาก P1/P2 และสูงสุดที่ P4 และรูปแบบนี้ยังคงที่ตลอดเวลา (รูปที่ 4a–f และรูปเสริม 8c–f, k) เพื่อวิเคราะห์โครงสร้างเชิงพื้นที่ของเซลล์ใน IPR ด้วยสัญญาณ GA ที่เพิ่มขึ้น เราได้ติดฉลากเซลล์ Ler IPR ไว้ด้านบนและด้านข้างของ P4 ตามชะตากรรมการพัฒนาที่วิเคราะห์ 34 ชั่วโมงหลังจากการสังเกตครั้งแรก กล่าวคือ มากกว่าเวลาพลาสติกสองครั้ง ทำให้เราสามารถติดตามเซลล์ IPR ได้ในระหว่างการพัฒนาขั้นต้นจาก P1/P2 ไปยัง P4 เราใช้สามสีที่แตกต่างกัน: สีเหลืองสำหรับเซลล์ที่รวมเข้ากับขั้นต้นใกล้กับ P4 สีเขียวสำหรับเซลล์ที่อยู่ใน IPR และสีม่วงสำหรับเซลล์ที่เข้าร่วมในทั้งสองกระบวนการ (รูปที่ 7a–c) เมื่อเวลา t0 (0 ชั่วโมง) เซลล์ IPR 1–2 ชั้นจะมองเห็นได้ด้านหน้า P4 (รูปที่ 7a) ตามที่คาดไว้ เมื่อเซลล์เหล่านี้แบ่งตัว เซลล์จะแบ่งตัวโดยหลักผ่านระนาบการแบ่งตามขวาง (รูปที่ 7a–c) ผลลัพธ์ที่คล้ายกันได้มาจากการใช้ Col-0 SAM (โดยเน้นที่ P3 ซึ่งขอบพับคล้ายกับ P4 ใน Ler) แม้ว่าในจีโนไทป์นี้ ขอบพับที่เกิดขึ้นที่ขอบดอกจะซ่อนเซลล์ IPR ได้เร็วขึ้น (รูปที่ 7g–i) ดังนั้น รูปแบบการแบ่งตัวของเซลล์ IPR จะจัดระเบียบเซลล์ล่วงหน้าเป็นแถวรัศมี เช่น ในปล้อง การจัดระเบียบของแถวรัศมีและตำแหน่งของเซลล์ IPR ระหว่างอวัยวะที่ต่อเนื่องกันแสดงให้เห็นว่าเซลล์เหล่านี้เป็นเซลล์ตั้งต้นของปล้อง
ที่นี่ เราได้พัฒนาไบโอเซนเซอร์การส่งสัญญาณ GA แบบ ratiometric qmRGA ซึ่งช่วยให้สามารถระบุปริมาณกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ที่เกิดจากความเข้มข้นของ GA และตัวรับ GA ร่วมกันได้ในขณะที่ลดการรบกวนกับเส้นทางการส่งสัญญาณภายในให้น้อยที่สุด จึงทำให้ได้ข้อมูลเกี่ยวกับการทำงานของ GA ในระดับเซลล์ เพื่อจุดประสงค์นี้ เราจึงสร้างโปรตีน DELLA ดัดแปลง mRGA ซึ่งสูญเสียความสามารถในการจับกับคู่โต้ตอบ DELLA แต่ยังคงไวต่อการสลายโปรตีนที่เกิดจาก GA qmRGA ตอบสนองต่อการเปลี่ยนแปลงของระดับ GA ทั้งจากภายนอกและภายใน และคุณสมบัติการตรวจจับแบบไดนามิกทำให้สามารถประเมินการเปลี่ยนแปลงในเชิงปริภูมิและเวลาในกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ในระหว่างการพัฒนาได้ qmRGA ยังเป็นเครื่องมือที่มีความยืดหยุ่นสูงเนื่องจากสามารถปรับใช้กับเนื้อเยื่อต่าง ๆ ได้โดยการเปลี่ยนโปรโมเตอร์ที่ใช้ในการแสดงออก (ถ้าจำเป็น) และเมื่อพิจารณาถึงลักษณะที่อนุรักษ์ไว้ของเส้นทางการส่งสัญญาณ GA และโมทีฟ PFYRE ในพืชใบเลี้ยงดอก จึงมีแนวโน้มที่จะถ่ายโอนไปยังสปีชีส์อื่นได้22 ซึ่งสอดคล้องกับสิ่งนี้ การกลายพันธุ์ที่เทียบเท่าในโปรตีน DELLA SLR1 ของข้าว (HYY497AAA) ยังแสดงให้เห็นว่าสามารถยับยั้งกิจกรรมของสารยับยั้งการเจริญเติบโตของ SLR1 ได้ ในขณะที่ลดการย่อยสลายที่เกิดจาก GA เพียงเล็กน้อย ซึ่งคล้ายกับ mRGA23 สิ่งที่น่าสังเกตคือ การศึกษาเมื่อเร็ว ๆ นี้ใน Arabidopsis แสดงให้เห็นว่าการกลายพันธุ์ของกรดอะมิโนเพียงตัวเดียวในโดเมน PFYRE (S474L) ทำให้กิจกรรมการถอดรหัสของ RGA เปลี่ยนไปโดยไม่ส่งผลกระทบต่อความสามารถในการโต้ตอบกับพันธมิตรของปัจจัยการถอดรหัส50 แม้ว่าการกลายพันธุ์นี้จะใกล้เคียงกับการแทนที่กรดอะมิโน 3 ตัวที่มีอยู่ใน mRGA มาก แต่การศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่าการกลายพันธุ์ทั้งสองนี้ทำให้ลักษณะเฉพาะของ DELLA เปลี่ยนไป แม้ว่าพันธมิตรปัจจัยการถอดรหัสส่วนใหญ่จะจับกับโดเมน LHR1 และ SAW ของ DELLA26,51 แต่กรดอะมิโนที่อนุรักษ์ไว้บางชนิดในโดเมน PFYRE ก็อาจช่วยให้การโต้ตอบเหล่านี้มีเสถียรภาพได้
การพัฒนาปล้องเป็นลักษณะสำคัญในสถาปัตยกรรมของพืชและการปรับปรุงผลผลิต qmRGA เผยให้เห็นกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ที่สูงขึ้นในเซลล์ต้นกำเนิดปล้อง IPR จากการผสมผสานการถ่ายภาพเชิงปริมาณและพันธุกรรม เราแสดงให้เห็นว่ารูปแบบการส่งสัญญาณ GA ซ้อนทับระนาบการแบ่งเซลล์แบบวงกลม/ตามขวางในชั้นหนังกำพร้า SAM ซึ่งกำหนดโครงสร้างการแบ่งเซลล์ที่จำเป็นสำหรับการพัฒนาปล้อง มีการระบุตัวควบคุมการวางแนวระนาบการแบ่งเซลล์หลายตัวในระหว่างการพัฒนา52,53 งานของเราให้ตัวอย่างที่ชัดเจนว่ากิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ควบคุมพารามิเตอร์ของเซลล์นี้อย่างไร DELLA สามารถโต้ตอบกับคอมเพล็กซ์โปรตีนที่พับไว้ล่วงหน้า41 ดังนั้นการส่งสัญญาณ GA อาจควบคุมการวางแนวระนาบการแบ่งเซลล์โดยส่งอิทธิพลโดยตรงต่อการวางแนวไมโครทูบูลในเปลือกสมอง40,41,54,55 เราแสดงให้เห็นโดยไม่คาดคิดว่าใน SAM ความสัมพันธ์ของกิจกรรมการส่งสัญญาณ GA ที่สูงขึ้นไม่ได้อยู่ที่การยืดออกหรือการแบ่งเซลล์ แต่เป็นเพียงความต่างไอโซทรอปิกของการเจริญเติบโต ซึ่งสอดคล้องกับผลโดยตรงของ GA ต่อทิศทางการแบ่งเซลล์ใน IPR อย่างไรก็ตาม เราไม่สามารถตัดออกได้ว่าผลกระทบนี้อาจเกิดขึ้นทางอ้อมได้ เช่น เกิดจากการอ่อนตัวของผนังเซลล์ที่เกิดจาก GA56 การเปลี่ยนแปลงคุณสมบัติของผนังเซลล์ทำให้เกิดความเครียดเชิงกล57,58 ซึ่งสามารถส่งผลต่อการวางแนวของระนาบการแบ่งเซลล์ได้เช่นกันโดยส่งผลต่อการวางแนวของไมโครทูบูลในเปลือกสมอง39,46,59 ผลรวมของความเครียดเชิงกลที่เกิดจาก GA และการควบคุมการวางแนวของไมโครทูบูลโดยตรงโดย GA อาจเกี่ยวข้องกับการสร้างรูปแบบเฉพาะของการวางแนวการแบ่งเซลล์ใน IPR เพื่อกำหนดปมประสาท และจำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อทดสอบแนวคิดนี้ ในทำนองเดียวกัน การศึกษาครั้งก่อนได้เน้นย้ำถึงความสำคัญของโปรตีนที่โต้ตอบกับ DELLA คือ TCP14 และ 15 ในการควบคุมการก่อตัวของปมประสาท60,61 และปัจจัยเหล่านี้อาจทำหน้าที่เป็นตัวกลางในการกระทำของ GA ร่วมกับ BREVIPEDICELLUS (BP) และ PENNYWISE (PNY) ซึ่งควบคุมการพัฒนาของปมประสาทและได้รับการพิสูจน์แล้วว่ามีอิทธิพลต่อการส่งสัญญาณของ GA2,62 เนื่องจาก DELLA โต้ตอบกับบราสซิโนสเตียรอยด์ เอทิลีน กรดจัสมอนิก และทางส่งสัญญาณกรดแอบซิซิก (ABA)63,64 และฮอร์โมนเหล่านี้สามารถส่งผลต่อการวางแนวของไมโครทูบูล65 ผลกระทบของ GA ต่อการวางแนวการแบ่งเซลล์จึงอาจเกิดจากฮอร์โมนอื่นๆ ได้เช่นกัน
การศึกษาทางเซลล์วิทยาในระยะแรกแสดงให้เห็นว่าทั้งบริเวณด้านในและด้านนอกของ SAM ของ Arabidopsis จำเป็นต่อการพัฒนาของปล้อง2,42 ความจริงที่ว่า GA ควบคุมการแบ่งเซลล์ในเนื้อเยื่อด้านใน12 อย่างแข็งขันสนับสนุนหน้าที่คู่ของ GA ในการควบคุมเนื้อเยื่อเจริญและขนาดของปล้องใน SAM รูปแบบการแบ่งเซลล์แบบมีทิศทางยังได้รับการควบคุมอย่างเข้มงวดในเนื้อเยื่อ SAM ด้านใน และการควบคุมนี้มีความจำเป็นต่อการเจริญเติบโตของลำต้น52 จะเป็นเรื่องที่น่าสนใจที่จะตรวจสอบว่า GA มีบทบาทในการกำหนดทิศทางของระนาบการแบ่งเซลล์ในองค์กร SAM ด้านในด้วยหรือไม่ ซึ่งจะทำให้การกำหนดและการพัฒนาของปล้องภายใน SAM สอดคล้องกัน
ปลูกพืชในหลอดทดลองในดินหรืออาหารเลี้ยงเชื้อ Murashige-Skoog (MS) 1x (Duchefa) เสริมด้วยซูโครส 1% และวุ้น 1% (Sigma) ภายใต้สภาวะมาตรฐาน (แสง 16 ชั่วโมง อุณหภูมิ 22 °C) ยกเว้นการทดลองการเจริญเติบโตของไฮโปโคทิลและรากซึ่งปลูกต้นกล้าบนจานแนวตั้งภายใต้แสงคงที่และอุณหภูมิ 22 °C สำหรับการทดลองไนเตรต พืชจะปลูกในอาหารเลี้ยงเชื้อ MS ดัดแปลง (อาหารเลี้ยงเชื้อ bioWORLD) เสริมด้วยไนเตรตที่เพียงพอ (KNO3 0 หรือ 10 mM) ซักซิเนต NH4 0.5 mM ซูโครส 1% และวุ้น A 1% (Sigma) ภายใต้สภาวะวันยาว
cDNA ของ GID1a ที่แทรกเข้าไปใน pDONR221 ถูกนำมาผสมใหม่กับ pDONR P4-P1R-pUBQ10 และ pDONR P2R-P3-mCherry ใน pB7m34GW เพื่อสร้าง pUBQ10::GID1a-mCherry DNA ของ IDD2 ที่แทรกเข้าไปใน pDONR221 ถูกนำมาผสมใหม่กับ pB7RWG266 เพื่อสร้าง p35S:IDD2-RFP ในการสร้าง pGID1b::2xmTQ2-GID1b จะต้องขยายชิ้นส่วนขนาด 3.9 kb ที่อยู่ต้นน้ำของบริเวณเข้ารหัส GID1b และชิ้นส่วนขนาด 4.7 kb ที่มี cDNA ของ GID1b (1.3 kb) และเทอร์มิเนเตอร์ (3.4 kb) ก่อนโดยใช้ไพรเมอร์ในตารางเสริมที่ 3 จากนั้นจึงแทรกเข้าใน pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) และ pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) ตามลำดับ และในที่สุดรวมเข้ากับ pDONR221 2xmTQ268 ในเวกเตอร์เป้าหมาย pGreen 012567 โดยใช้การโคลนเกตเวย์ ในการสร้าง pCUC2::LSSmOrange ลำดับโปรโมเตอร์ CUC2 (3229 bp ก่อน ATG) ตามด้วยลำดับการเข้ารหัสของ mOrange ที่เลื่อนสโตกส์ขนาดใหญ่ (LSSmOrange)69 ที่มีสัญญาณการแปลตำแหน่งนิวเคลียส N7 และตัวยุติการถอดรหัส NOS ถูกประกอบเข้าในเวกเตอร์เป้าหมายคาเนมัยซิน pGreen โดยใช้ระบบการรวมตัว 3-fragment Gateway (Invitrogen) เวกเตอร์ไบนารีของพืชถูกนำเข้าสู่สายพันธุ์ GV3101 ของ Agrobacterium tumefaciens และถูกนำเข้าสู่ใบของ Nicotiana benthamiana โดยวิธีการแทรกซึมของ Agrobacterium และเข้าสู่ Arabidopsis thaliana Col-0 โดยวิธีการจุ่มดอกไม้ตามลำดับ pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry และ pCLV3::mCherry-NLS qmRGA ถูกแยกจากลูกหลาน F3 และ F1 ของการผสมพันธุ์ตามลำดับ
การผสมพันธุ์ RNA ในแหล่งกำเนิดดำเนินการบนปลายยอดยาวประมาณ 1 ซม.72 ซึ่งรวบรวมและตรึงทันทีในสารละลาย FAA (ฟอร์มาลดีไฮด์ 3.7% กรดอะซิติก 5% เอธานอล 50%) ที่ทำให้เย็นลงล่วงหน้าที่ 4 °C หลังจากการบำบัดด้วยสุญญากาศ 2 × 15 นาที เปลี่ยนสารตรึงและฟักตัวอย่างข้ามคืน สังเคราะห์ cDNA ของ GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 และ RGL3 และโพรบแอนติเซนส์กับ 3'-UTR โดยใช้ไพรเมอร์ที่แสดงในตารางเสริม 3 ตามที่อธิบายโดย Rosier et al.73 โพรบที่ติดฉลากด้วยดิโกซิเจนินได้รับการตรวจจับทางภูมิคุ้มกันโดยใช้แอนติบอดีดิโกซิเจนิน (เจือจาง 3,000 เท่า; Roche หมายเลขแค็ตตาล็อก: 11 093 274 910) และส่วนต่างๆ ถูกย้อมด้วยสารละลาย 5-โบรโม-4-คลอโร-3-อินโดลิลฟอสเฟต (BCIP เจือจาง 250 เท่า)/ไนโตรบลูเตตระโซเลียม (NBT เจือจาง 200 เท่า)