อัตราการตายและความเป็นพิษของสารไซเปอร์เมทรีนที่จำหน่ายในเชิงพาณิชย์ต่อลูกอ๊อดน้ำขนาดเล็ก

การศึกษาครั้งนี้ประเมินอัตราการเสียชีวิต อัตราการเสียชีวิตที่ไม่ถึงขั้นเสียชีวิต และความเป็นพิษของผลิตภัณฑ์เชิงพาณิชย์ไซเปอร์เมทรินมีการทดสอบสารประกอบไซเปอร์เมทรินในสูตรต่างๆ กับลูกอ๊อดของกบ ในการทดสอบแบบเฉียบพลัน ทดสอบความเข้มข้น 100–800 ไมโครกรัม/ลิตร เป็นเวลา 96 ชั่วโมง ในการทดสอบแบบเรื้อรัง ทดสอบความเข้มข้นของไซเปอร์เมทรินที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติ (1, 3, 6 และ 20 ไมโครกรัม/ลิตร) เพื่อดูอัตราการตาย ตามด้วยการทดสอบไมโครนิวเคลียสและความผิดปกติของนิวเคลียสในเม็ดเลือดแดงเป็นเวลา 7 วัน ค่า LC50 ของสารประกอบไซเปอร์เมทรินเชิงพาณิชย์ต่อลูกอ๊อดคือ 273.41 ไมโครกรัม/ลิตร ในการทดสอบแบบเรื้อรัง ความเข้มข้นสูงสุด (20 ไมโครกรัม/ลิตร) ส่งผลให้อัตราการตายมากกว่า 50% เนื่องจากฆ่าลูกอ๊อดที่ทดสอบไปครึ่งหนึ่ง การทดสอบไมโครนิวเคลียสแสดงผลที่สำคัญที่ 6 และ 20 ไมโครกรัม/ลิตร และตรวจพบความผิดปกติของนิวเคลียสหลายอย่าง ซึ่งบ่งชี้ว่าสารประกอบไซเปอร์เมทรินเชิงพาณิชย์มีศักยภาพในการก่อให้เกิดการกลายพันธุ์ในกบ P. gracilis ไซเปอร์เมทรินเป็นอันตรายอย่างมากต่อสายพันธุ์นี้ ซึ่งบ่งชี้ว่าสามารถก่อให้เกิดปัญหาหลายประการและส่งผลกระทบต่อพลวัตของระบบนิเวศนี้ทั้งในระยะสั้นและระยะยาว ดังนั้นจึงสรุปได้ว่าสารประกอบไซเปอร์เมทรินในเชิงพาณิชย์มีฤทธิ์เป็นพิษต่อ P. gracilis
เนื่องจากการขยายตัวอย่างต่อเนื่องของกิจกรรมทางการเกษตรและการประยุกต์ใช้อย่างเข้มข้นของการควบคุมศัตรูพืชจากมาตรการต่างๆ สัตว์น้ำมักได้รับสารกำจัดศัตรูพืช1,2 มลพิษในแหล่งน้ำใกล้พื้นที่เกษตรกรรมอาจส่งผลกระทบต่อการเจริญเติบโตและการอยู่รอดของสิ่งมีชีวิตที่ไม่ใช่เป้าหมาย เช่น สัตว์สะเทินน้ำสะเทินบก
สัตว์สะเทินน้ำสะเทินบกกำลังมีความสำคัญมากขึ้นเรื่อยๆ ในการประเมินเมทริกซ์สิ่งแวดล้อม สัตว์ในกลุ่มกบและคางคกถือเป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพที่ดีของมลพิษทางสิ่งแวดล้อมเนื่องจากลักษณะเฉพาะ เช่น วงจรชีวิตที่ซับซ้อน อัตราการเจริญเติบโตของตัวอ่อนที่รวดเร็ว สถานะทางโภชนาการ ผิวหนังที่ซึมผ่านได้10,11 การพึ่งพาน้ำในการสืบพันธุ์12 และไข่ที่ไม่ได้รับการปกป้อง11,13,14 กบน้ำตัวเล็ก (Physalaemus gracilis) หรือที่รู้จักกันทั่วไปว่ากบร้องไห้ ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าเป็นชนิดพันธุ์ตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของมลพิษจากยาฆ่าแมลง4,5,6,7,15 ชนิดนี้พบได้ในแหล่งน้ำนิ่ง พื้นที่คุ้มครอง หรือพื้นที่ที่มีถิ่นที่อยู่หลากหลายในอาร์เจนตินา อุรุกวัย ปารากวัย และบราซิล1617 และถือว่ามีเสถียรภาพตามการจำแนกประเภทของ IUCN เนื่องจากมีการกระจายตัวอย่างกว้างขวางและทนต่อถิ่นที่อยู่ต่างๆ ได้18
มีการรายงานผลกระทบที่ไม่ถึงขั้นเสียชีวิตในสัตว์สะเทินน้ำสะเทินบกภายหลังการสัมผัสกับไซเปอร์เมทริน ซึ่งรวมถึงการเปลี่ยนแปลงทางพฤติกรรม รูปร่าง และชีวเคมีในลูกอ๊อด23,24,25 การเปลี่ยนแปลงอัตราการตายและเวลาการเปลี่ยนแปลงรูปร่าง การเปลี่ยนแปลงของเอนไซม์ การลดลงของอัตราการฟักไข่24,25 ภาวะไฮเปอร์แอคทีฟ26 การยับยั้งกิจกรรมของโคลีนเอสเตอเรส27 และการเปลี่ยนแปลงในประสิทธิภาพการว่ายน้ำ7,28 อย่างไรก็ตาม การศึกษาเกี่ยวกับผลกระทบทางพันธุกรรมของไซเปอร์เมทรินในสัตว์สะเทินน้ำสะเทินบกยังมีจำกัด ดังนั้นจึงเป็นสิ่งสำคัญที่จะต้องประเมินความไวของสัตว์สะเทินน้ำสะเทินบกต่อไซเปอร์เมทริน
มลภาวะทางสิ่งแวดล้อมส่งผลกระทบต่อการเจริญเติบโตและพัฒนาการตามปกติของสัตว์ครึ่งบกครึ่งน้ำ แต่ผลกระทบที่ร้ายแรงที่สุดคือความเสียหายทางพันธุกรรมต่อดีเอ็นเอที่เกิดจากการสัมผัสสารกำจัดศัตรูพืช13 การวิเคราะห์สัณฐานวิทยาของเซลล์เม็ดเลือดเป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพที่สำคัญของมลภาวะและความเป็นพิษที่อาจเกิดขึ้นของสารต่อสัตว์ป่า29 การทดสอบไมโครนิวเคลียสเป็นหนึ่งในวิธีการที่ใช้กันอย่างแพร่หลายที่สุดในการกำหนดความเป็นพิษต่อพันธุกรรมของสารเคมีในสิ่งแวดล้อม30 เป็นวิธีการที่รวดเร็ว มีประสิทธิภาพ และราคาไม่แพง ซึ่งเป็นตัวบ่งชี้ที่ดีของมลภาวะทางเคมีของสิ่งมีชีวิต เช่น สัตว์ครึ่งบกครึ่งน้ำ31,32 และสามารถให้ข้อมูลเกี่ยวกับการสัมผัสกับมลพิษที่เป็นพิษต่อพันธุกรรมได้33
วัตถุประสงค์ของการศึกษาครั้งนี้คือการประเมินศักยภาพความเป็นพิษของสารไซเปอร์เมทรินในเชิงพาณิชย์ต่อลูกอ๊อดน้ำขนาดเล็กโดยใช้การทดสอบไมโครนิวเคลียสและการประเมินความเสี่ยงทางนิเวศวิทยา
อัตราการตายสะสม (%) ของลูกอ๊อด P. gracilis ที่สัมผัสกับสารไซเปอร์เมทรินเชิงพาณิชย์ในความเข้มข้นต่างๆ ในช่วงระยะเฉียบพลันของการทดสอบ
อัตราการตายสะสม (%) ของลูกอ๊อด P. gracilis ที่สัมผัสกับสารไซเปอร์เมทรินเชิงพาณิชย์ในความเข้มข้นต่างๆ ระหว่างการทดสอบเรื้อรัง
อัตราการตายที่สูงที่สังเกตพบนั้นเป็นผลมาจากผลกระทบทางพันธุกรรมในสัตว์สะเทินน้ำสะเทินบกที่สัมผัสกับไซเปอร์เมทรินในความเข้มข้นต่างๆ (6 และ 20 ไมโครกรัม/ลิตร) ดังที่เห็นได้จากการมีไมโครนิวเคลียส (MN) และความผิดปกติของนิวเคลียสในเม็ดเลือดแดง การก่อตัวของ MN บ่งชี้ถึงข้อผิดพลาดในการแบ่งเซลล์แบบไมโทซิส และเกี่ยวข้องกับการจับตัวของโครโมโซมกับไมโครทูบูลที่ไม่ดี ความบกพร่องในโปรตีนคอมเพล็กซ์ที่รับผิดชอบในการดูดซับและขนส่งโครโมโซม ข้อผิดพลาดในการแยกโครโมโซม และข้อผิดพลาดในการซ่อมแซมความเสียหายของ DNA38,39 และอาจเกี่ยวข้องกับความเครียดออกซิเดชันที่เกิดจากยาฆ่าแมลง40,41 ความผิดปกติอื่นๆ ถูกสังเกตพบในทุกความเข้มข้นที่ประเมิน การเพิ่มความเข้มข้นของไซเปอร์เมทรินทำให้ความผิดปกติของนิวเคลียสในเม็ดเลือดแดงเพิ่มขึ้น 5% และ 20% ที่ปริมาณต่ำสุด (1 ไมโครกรัม/ลิตร) และสูงสุด (20 ไมโครกรัม/ลิตร) ตามลำดับ ตัวอย่างเช่น การเปลี่ยนแปลงในดีเอ็นเอของสิ่งมีชีวิตชนิดหนึ่งอาจส่งผลร้ายแรงต่อการอยู่รอดทั้งในระยะสั้นและระยะยาว ส่งผลให้ประชากรลดลง ความสามารถในการสืบพันธุ์เปลี่ยนแปลงไป การผสมพันธุ์ในหมู่ญาติ การสูญเสียความหลากหลายทางพันธุกรรม และอัตราการอพยพเปลี่ยนแปลงไป ปัจจัยทั้งหมดเหล่านี้สามารถส่งผลกระทบต่อการอยู่รอดและการดำรงอยู่ของสิ่งมีชีวิตได้42,43 การเกิดความผิดปกติของเม็ดเลือดแดงอาจบ่งชี้ถึงการปิดกั้นในกระบวนการแบ่งเซลล์ ส่งผลให้เกิดการแบ่งเซลล์ที่ผิดปกติ (เม็ดเลือดแดงที่มีนิวเคลียสสองอัน)44,45 นิวเคลียสที่มีหลายแฉกเป็นส่วนที่ยื่นออกมาจากเยื่อหุ้มนิวเคลียสที่มีหลายแฉก46 ในขณะที่ความผิดปกติของเม็ดเลือดแดงอื่นๆ อาจเกี่ยวข้องกับการเพิ่มจำนวนดีเอ็นเอ เช่น ไตนิวเคลียส/ถุงนิวเคลียส47 การมีเม็ดเลือดแดงที่ไม่มีนิวเคลียสอาจบ่งชี้ถึงการขนส่งออกซิเจนที่บกพร่อง โดยเฉพาะในน้ำที่ปนเปื้อน48,49 อะพอพโทซิสบ่งชี้ถึงการตายของเซลล์50
งานวิจัยอื่นๆ ยังได้แสดงให้เห็นถึงผลกระทบทางพันธุกรรมของไซเปอร์เมทรินด้วย Kabaña et al.51 ได้แสดงให้เห็นถึงการปรากฏของไมโครนิวเคลียสและการเปลี่ยนแปลงของนิวเคลียส เช่น เซลล์ที่มีสองนิวเคลียสและเซลล์ที่เกิดภาวะอะพอพโทซิสในเซลล์ของ Odontophrynus americanus หลังจากได้รับไซเปอร์เมทรินในความเข้มข้นสูง (5000 และ 10,000 μg L−1) เป็นเวลา 96 ชั่วโมง นอกจากนี้ยังตรวจพบภาวะอะพอพโทซิสที่เกิดจากไซเปอร์เมทรินใน P. biligonigerus52 และ Rhinella arenarum53 ด้วย ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าไซเปอร์เมทรินมีผลกระทบทางพันธุกรรมต่อสิ่งมีชีวิตในน้ำหลายชนิด และการทดสอบ MN และ ENA อาจเป็นตัวบ่งชี้ผลกระทบที่ไม่ถึงแก่ชีวิตต่อสัตว์สะเทินน้ำสะเทินบก และอาจใช้ได้กับสายพันธุ์พื้นเมืองและประชากรป่าที่สัมผัสกับสารพิษ12
สารไซเปอร์เมทรินในเชิงพาณิชย์ก่อให้เกิดอันตรายต่อสิ่งแวดล้อมสูง (ทั้งแบบเฉียบพลันและเรื้อรัง) โดยมีค่า HQ เกินระดับที่กำหนดโดยสำนักงานคุ้มครองสิ่งแวดล้อมแห่งสหรัฐอเมริกา (EPA)54 ซึ่งอาจส่งผลเสียต่อสิ่งมีชีวิตหากมีอยู่ในสิ่งแวดล้อม ในการประเมินความเสี่ยงเรื้อรัง ค่า NOEC สำหรับการตายอยู่ที่ 3 μg L−1 ซึ่งยืนยันว่าความเข้มข้นที่พบในน้ำอาจเป็นอันตรายต่อสิ่งมีชีวิต55 ค่า NOEC ที่เป็นอันตรายถึงชีวิตสำหรับตัวอ่อนของ R. arenarum ที่สัมผัสกับส่วนผสมของเอนโดซัลแฟนและไซเปอร์เมทรินคือ 500 μg L−1 หลังจาก 168 ชั่วโมง ค่านี้ลดลงเหลือ 0.0005 μg L−1 หลังจาก 336 ชั่วโมง ผู้เขียนแสดงให้เห็นว่ายิ่งระยะเวลาการสัมผัสนานเท่าใด ความเข้มข้นที่เป็นอันตรายต่อสิ่งมีชีวิตก็จะยิ่งต่ำลงเท่านั้น นอกจากนี้ยังเป็นสิ่งสำคัญที่จะต้องเน้นว่าค่า NOEC สูงกว่าของ P. gracilis ในช่วงเวลาการสัมผัสเดียวกัน ซึ่งบ่งชี้ว่าการตอบสนองของสิ่งมีชีวิตต่อไซเปอร์เมทรินนั้นแตกต่างกันไปตามชนิดของสิ่งมีชีวิต นอกจากนี้ ในแง่ของอัตราการตาย ค่า CHQ ของ P. gracilis หลังจากสัมผัสกับไซเปอร์เมทรินสูงถึง 64.67 ซึ่งสูงกว่าค่าอ้างอิงที่กำหนดโดยสำนักงานคุ้มครองสิ่งแวดล้อมแห่งสหรัฐอเมริกา54 และค่า CHQ ของตัวอ่อน R. arenarum ก็สูงกว่าค่านี้เช่นกัน (CHQ > 388.00 หลังจาก 336 ชั่วโมง) แสดงให้เห็นว่ายาฆ่าแมลงที่ศึกษามีความเสี่ยงสูงต่อสัตว์สะเทินน้ำสะเทินบกหลายชนิด เมื่อพิจารณาว่า P. gracilis ต้องใช้เวลาประมาณ 30 วันในการเปลี่ยนแปลงรูปร่าง56 จึงสรุปได้ว่าความเข้มข้นของไซเปอร์เมทรินที่ศึกษาอาจส่งผลให้ประชากรลดลงโดยการป้องกันไม่ให้สัตว์ที่ติดเชื้อเข้าสู่ระยะตัวเต็มวัยหรือระยะสืบพันธุ์ตั้งแต่อายุยังน้อย
จากการประเมินความเสี่ยงของไมโครนิวเคลียสและความผิดปกติของนิวเคลียสเม็ดเลือดแดงอื่นๆ ค่า CHQ อยู่ในช่วง 14.92 ถึง 97.00 ซึ่งบ่งชี้ว่าไซเปอร์เมทรินมีความเสี่ยงต่อการกลายพันธุ์ทางพันธุกรรมใน P. gracilis แม้ในถิ่นที่อยู่ตามธรรมชาติ เมื่อพิจารณาถึงอัตราการตาย ความเข้มข้นสูงสุดของสารประกอบแปลกปลอมที่ P. gracilis สามารถทนได้คือ 4.24 μg L−1 อย่างไรก็ตาม ความเข้มข้นต่ำเพียง 1 μg/L ก็แสดงผลกระทบต่อการกลายพันธุ์ทางพันธุกรรมเช่นกัน ข้อเท็จจริงนี้อาจนำไปสู่การเพิ่มขึ้นของจำนวนตัวที่ผิดปกติ57 และส่งผลกระทบต่อการพัฒนาและการสืบพันธุ์ของสายพันธุ์ในถิ่นที่อยู่ ทำให้ประชากรของสัตว์สะเทินน้ำสะเทินบกลดลง
สูตรเชิงพาณิชย์ของยาฆ่าแมลงไซเปอร์เมทรินแสดงความเป็นพิษเฉียบพลันและเรื้อรังสูงต่อ P. gracilis พบอัตราการตายที่สูงขึ้น ซึ่งน่าจะเกิดจากผลกระทบที่เป็นพิษ ดังที่เห็นได้จากการพบไมโครนิวเคลียสและความผิดปกติของนิวเคลียสในเม็ดเลือดแดง โดยเฉพาะอย่างยิ่งนิวเคลียสหยัก นิวเคลียสเป็นกลีบ และนิวเคลียสเป็นถุง นอกจากนี้ สายพันธุ์ที่ศึกษายังแสดงให้เห็นถึงความเสี่ยงต่อสิ่งแวดล้อมที่เพิ่มขึ้นทั้งในระยะเฉียบพลันและเรื้อรัง ข้อมูลเหล่านี้ เมื่อรวมกับการศึกษาครั้งก่อนๆ ของกลุ่มวิจัยของเรา แสดงให้เห็นว่าแม้แต่สูตรเชิงพาณิชย์ที่แตกต่างกันของไซเปอร์เมทรินก็ยังทำให้กิจกรรมของอะเซทิลโคลีนเอสเทอเรส (AChE) และบิวทิริลโคลีนเอสเทอเรส (BChE) ลดลง และเกิดความเครียดออกซิเดชัน58 และส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในกิจกรรมการว่ายน้ำและความผิดปกติของช่องปาก59 ใน P. gracilis ซึ่งบ่งชี้ว่าสูตรเชิงพาณิชย์ของไซเปอร์เมทรินมีความเป็นพิษถึงตายและไม่ถึงตายสูงต่อสายพันธุ์นี้ Hartmann et al. งานวิจัยหมายเลข 60 พบว่า สารไซเปอร์เมทรินในเชิงพาณิชย์มีความเป็นพิษต่อ P. gracilis และอีกสายพันธุ์หนึ่งในสกุลเดียวกัน (P. cuvieri) มากที่สุด เมื่อเทียบกับสารกำจัดศัตรูพืชอื่นๆ อีก 9 ชนิด นี่แสดงให้เห็นว่า ความเข้มข้นของไซเปอร์เมทรินที่ได้รับการอนุมัติตามกฎหมายเพื่อการปกป้องสิ่งแวดล้อม อาจส่งผลให้มีอัตราการตายสูงและประชากรลดลงในระยะยาว
จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อประเมินความเป็นพิษของยาฆ่าแมลงต่อสัตว์สะเทินน้ำสะเทินบก เนื่องจากความเข้มข้นที่พบในสิ่งแวดล้อมอาจทำให้มีอัตราการตายสูงและเป็นอันตรายต่อ P. gracilis ได้ ควรส่งเสริมการวิจัยเกี่ยวกับสัตว์สะเทินน้ำสะเทินบก เนื่องจากข้อมูลเกี่ยวกับสิ่งมีชีวิตเหล่านี้มีน้อย โดยเฉพาะอย่างยิ่งในสายพันธุ์ของบราซิล
การทดสอบความเป็นพิษเรื้อรังใช้เวลา 168 ชั่วโมง (7 วัน) ภายใต้สภาวะคงที่ และความเข้มข้นที่ไม่เป็นอันตรายถึงชีวิต ได้แก่ 1, 3, 6 และ 20 ไมโครกรัมต่อลิตร ในการทดลองทั้งสองครั้ง ลูกอ๊อด 10 ตัวต่อกลุ่มทดลองได้รับการประเมิน โดยทำซ้ำ 6 ครั้ง รวมเป็นลูกอ๊อดทั้งหมด 60 ตัวต่อความเข้มข้น ในขณะเดียวกัน การทดลองที่ใช้น้ำเปล่าอย่างเดียวทำหน้าที่เป็นกลุ่มควบคุมเชิงลบ การจัดเตรียมการทดลองแต่ละครั้งประกอบด้วยจานแก้วปลอดเชื้อขนาด 500 มิลลิลิตร และความหนาแน่นของลูกอ๊อด 1 ตัวต่อสารละลาย 50 มิลลิลิตร ขวดถูกปิดด้วยฟิล์มโพลีเอทิลีนเพื่อป้องกันการระเหยและมีการเติมอากาศอย่างต่อเนื่อง
มีการวิเคราะห์ทางเคมีของน้ำเพื่อหาความเข้มข้นของสารกำจัดศัตรูพืชที่เวลา 0, 96 และ 168 ชั่วโมง ตามที่ Sabin et al. 68 และ Martins et al. 69 ระบุไว้ การวิเคราะห์ดำเนินการที่ห้องปฏิบัติการวิเคราะห์สารกำจัดศัตรูพืช (LARP) ของมหาวิทยาลัยแห่งรัฐซานตามาเรีย โดยใช้แก๊สโครมาโทกราฟีร่วมกับแมสสเปกโทรเมตรีแบบควอดรูโพลสามตัว (Varian รุ่น 1200, Palo Alto, California, USA) การหาปริมาณสารกำจัดศัตรูพืชในน้ำแสดงไว้ในเอกสารเสริม (ตาราง SM1)
สำหรับการทดสอบไมโครนิวเคลียส (MNT) และการทดสอบความผิดปกติของนิวเคลียสในเซลล์เม็ดเลือดแดง (RNA) ได้ทำการวิเคราะห์ลูกอ๊อดจำนวน 15 ตัวจากแต่ละกลุ่มทดลอง โดยให้ลูกอ๊อดสลบด้วยลิโดเคน 5% (50 มก./กรัม) และเก็บตัวอย่างเลือดโดยการเจาะหัวใจโดยใช้เข็มฉีดยาแบบใช้แล้วทิ้งที่มีเฮปาริน เตรียมสไลด์เลือดบนสไลด์กล้องจุลทรรศน์ที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว ตากให้แห้ง ตรึงด้วยเมทานอล 100% (4 °C) เป็นเวลา 2 นาที จากนั้นย้อมด้วยสารละลาย Giemsa 10% เป็นเวลา 15 นาทีในที่มืด เมื่อเสร็จสิ้นกระบวนการ ล้างสไลด์ด้วยน้ำกลั่นเพื่อขจัดสีย้อมส่วนเกินและทำให้แห้งที่อุณหภูมิห้อง
วิเคราะห์เม็ดเลือดแดงอย่างน้อย 1,000 เซลล์จากลูกอ๊อดแต่ละตัวโดยใช้กล้องจุลทรรศน์กำลังขยาย 100 เท่า พร้อมเลนส์วัตถุ 71 เท่า เพื่อตรวจสอบการมีอยู่ของ MN และ ENA ประเมินเม็ดเลือดแดงทั้งหมด 75,796 เซลล์จากลูกอ๊อด โดยพิจารณาความเข้มข้นของไซเปอร์เมทรินและกลุ่มควบคุม วิเคราะห์ความเป็นพิษต่อพันธุกรรมตามวิธีการของ Carrasco et al. และ Fenech et al.38,72 โดยกำหนดความถี่ของรอยโรคในนิวเคลียสดังต่อไปนี้: (1) เซลล์ที่ไม่มีนิวเคลียส: เซลล์ที่ไม่มีนิวเคลียส; (2) เซลล์อะพอพโทซิส: การแตกตัวของนิวเคลียส การตายของเซลล์ตามโปรแกรม; (3) เซลล์ที่มีสองนิวเคลียส: เซลล์ที่มีสองนิวเคลียส; (4) เซลล์ที่มีนิวเคลียสยื่นออกมาเล็กน้อยหรือเซลล์ที่มีถุง: เซลล์ที่มีนิวเคลียสที่มีส่วนยื่นเล็กๆ ของเยื่อหุ้มนิวเคลียส ถุงที่มีขนาดคล้ายกับไมโครนิวเคลียส; (5) เซลล์ที่มีนิวเคลียสสลาย: เซลล์ที่มีเพียงโครงร่างของนิวเคลียสโดยไม่มีสารภายใน (6) เซลล์ที่มีรอยบาก: เซลล์ที่มีนิวเคลียสที่มีรอยแตกหรือรอยบากที่เห็นได้ชัดเจนในรูปร่าง เรียกอีกอย่างว่านิวเคลียสรูปไต; (7) เซลล์ที่มีกลีบ: เซลล์ที่มีนิวเคลียสยื่นออกมาใหญ่กว่าถุงที่กล่าวมาข้างต้น; และ (8) ไมโครเซลล์: เซลล์ที่มีนิวเคลียสที่อัดแน่นและไซโตพลาซึมลดลง การเปลี่ยนแปลงเหล่านี้ถูกเปรียบเทียบกับผลลัพธ์ของกลุ่มควบคุมเชิงลบ
ผลการทดสอบความเป็นพิษเฉียบพลัน (LC50) ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ GBasic และวิธีการ TSK-Trimmed Spearman-Karber74 ข้อมูลการทดสอบเรื้อรังได้รับการทดสอบเบื้องต้นเพื่อหาความปกติของความคลาดเคลื่อน (Shapiro-Wilks) และความเป็นเอกรูปของความแปรปรวน (Bartlett) ผลลัพธ์ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียว (ANOVA) ใช้การทดสอบของ Tukey เพื่อเปรียบเทียบข้อมูลระหว่างกัน และใช้การทดสอบของ Dunnett เพื่อเปรียบเทียบข้อมูลระหว่างกลุ่มทดลองและกลุ่มควบคุมเชิงลบ
ข้อมูล LOEC และ NOEC ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้การทดสอบของ Dunnett การทดสอบทางสถิติได้ดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ Statistica 8.0 (StatSoft) ที่ระดับนัยสำคัญ 95% (p < 0.05)