การระบุและวิเคราะห์การแสดงออกของปัจจัยควบคุมการเจริญเติบโตของมัสตาร์ดทั่วทั้งจีโนมภายใต้สภาวะแห้งแล้ง

การกระจายตัวของปริมาณน้ำฝนตามฤดูกาลในมณฑลกุ้ยโจวนั้นไม่สม่ำเสมอ โดยมีปริมาณน้ำฝนมากกว่าในฤดูใบไม้ผลิและฤดูร้อน แต่ต้นกล้าเรพซีดจะอ่อนไหวต่อความเครียดจากภัยแล้งในฤดูใบไม้ร่วงและฤดูหนาว ซึ่งส่งผลกระทบอย่างร้ายแรงต่อผลผลิต มัสตาร์ดเป็นพืชน้ำมันพิเศษที่ปลูกส่วนใหญ่ในมณฑลกุ้ยโจว มีความทนทานต่อภัยแล้งสูงและสามารถปลูกได้ในพื้นที่ภูเขา เป็นแหล่งทรัพยากรยีนที่ต้านทานภัยแล้งอย่างอุดมสมบูรณ์ การค้นพบยีนต้านทานภัยแล้งมีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการปรับปรุงพันธุ์มัสตาร์ดและนวัตกรรมในทรัพยากรพลาสมาพันธุกรรม ตระกูล GRF มีบทบาทสำคัญในการเจริญเติบโตและการพัฒนาของพืชและการตอบสนองต่อความเครียดจากภัยแล้ง ปัจจุบันพบยีน GRF ใน Arabidopsis 2 ข้าว (Oryza sativa) 12 เรพซีด 13 ฝ้าย (Gossypium hirsutum) 14 ข้าวสาลี (Triticum) 15, ข้าวฟ่าง (Setaria italica)16 และ Brassica17 แต่ไม่มีรายงานการตรวจพบยีน GRF ในมัสตาร์ด ในการศึกษานี้ ยีนตระกูล GRF ของมัสตาร์ดได้รับการระบุที่ระดับจีโนมทั้งหมด และลักษณะทางกายภาพและเคมี ความสัมพันธ์ในวิวัฒนาการ โฮโมโลยี ลวดลายอนุรักษ์ โครงสร้างยีน การจำลองยีน องค์ประกอบซิส และระยะต้นกล้า (ระยะสี่ใบ) ได้รับการวิเคราะห์ รูปแบบการแสดงออกภายใต้ความเครียดจากภัยแล้งได้รับการวิเคราะห์อย่างครอบคลุมเพื่อให้มีพื้นฐานทางวิทยาศาสตร์สำหรับการศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับหน้าที่ที่เป็นไปได้ของยีน BjGRF ในการตอบสนองต่อภัยแล้ง และเพื่อจัดเตรียมยีนตัวเลือกสำหรับการผสมพันธุ์มัสตาร์ดที่ทนแล้ง
ยีน BjGRF จำนวน 34 ยีนได้รับการระบุในจีโนม Brassica juncea โดยใช้การค้นหา HMMER สองครั้ง ซึ่งทั้งหมดมีโดเมน QLQ และ WRC ลำดับ CDS ของยีน BjGRF ที่ระบุได้แสดงอยู่ในตารางเสริม S1 ยีน BjGRF01–BjGRF34 ได้รับการตั้งชื่อตามตำแหน่งบนโครโมโซม คุณสมบัติทางฟิสิกเคมีของตระกูลนี้บ่งชี้ว่าความยาวของกรดอะมิโนนั้นแปรผันได้มาก โดยอยู่ในช่วง 261 aa (BjGRF19) ถึง 905 aa (BjGRF28) จุดไอโซอิเล็กทริกของ BjGRF อยู่ในช่วง 6.19 (BjGRF02) ถึง 9.35 (BjGRF03) โดยมีค่าเฉลี่ยอยู่ที่ 8.33 และ 88.24% ของ BjGRF เป็นโปรตีนเบส ช่วงน้ำหนักโมเลกุลที่คาดการณ์ของ BjGRF อยู่ที่ 29.82 kDa (BjGRF19) ถึง 102.90 kDa (BjGRF28) ดัชนีความไม่เสถียรของโปรตีน BjGRF อยู่ที่ 51.13 (BjGRF08) ถึง 78.24 (BjGRF19) ซึ่งทั้งหมดมีค่ามากกว่า 40 ซึ่งบ่งชี้ว่าดัชนีกรดไขมันอยู่ที่ 43.65 (BjGRF01) ถึง 78.78 (BjGRF22) ค่าความชอบน้ำเฉลี่ย (GRAVY) อยู่ที่ -1.07 (BjGRF31) ถึง -0.45 (BjGRF22) โปรตีน BjGRF ที่ชอบน้ำทั้งหมดมีค่า GRAVY เป็นลบ ซึ่งอาจเกิดจากการขาดคุณสมบัติไม่ชอบน้ำที่เกิดจากสารตกค้าง การทำนายตำแหน่งย่อยในเซลล์แสดงให้เห็นว่าโปรตีนที่เข้ารหัส BjGRF จำนวน 31 ตัวสามารถอยู่ในนิวเคลียส BjGRF04 สามารถอยู่ในเปอร์ออกซิโซม BjGRF25 สามารถอยู่ในไซโตพลาซึม และ BjGRF28 สามารถอยู่ในคลอโรพลาสต์ได้ (ตารางที่ 1) ซึ่งบ่งชี้ว่า BjGRF อาจอยู่ในนิวเคลียสและมีบทบาทสำคัญในการควบคุมเป็นปัจจัยการถอดรหัส
การวิเคราะห์เชิงวิวัฒนาการของวงศ์ GRF ในสปีชีส์ต่างๆ สามารถช่วยศึกษาหน้าที่ของยีนได้ ดังนั้น จึงได้ดาวน์โหลดลำดับกรดอะมิโนเต็มความยาวของ GRF จากต้นเรพซีด 35 ต้น หัวผักกาด 16 ต้น ข้าว 12 ต้น ข้าวฟ่าง 10 ต้น และ Arabidopsis 9 ต้น และสร้างแผนภูมิวิวัฒนาการโดยอาศัยยีน BjGRF ที่ระบุได้ 34 ยีน (รูปที่ 1) วงศ์ย่อยทั้งสามนี้มีจำนวนสมาชิกต่างกัน โดย GRF TF จำนวน 116 ตัวแบ่งออกเป็น 3 วงศ์ย่อย (กลุ่ม A~C) โดยมี GRF 59 ตัว (50.86%), 34 ตัว (29.31%) และ 23 ตัว (19.83)% ตามลำดับ ในจำนวนนี้ มีสมาชิกวงศ์ BjGRF จำนวน 34 ตัวกระจายอยู่ใน 3 วงศ์ย่อย ได้แก่ สมาชิก 13 ตัวในกลุ่ม A (38.24%) สมาชิก 12 ตัวในกลุ่ม B (35.29%) และสมาชิก 9 ตัวในกลุ่ม C (26.47%) ในกระบวนการโพลีพลอยด์ของมัสตาร์ด จำนวนยีน BjGRFs ในวงศ์ย่อยต่างๆ จะแตกต่างกัน และอาจเกิดการขยายตัวและการสูญเสียยีนขึ้นได้ ควรสังเกตว่าไม่มีการกระจายตัวของ GRF ข้าวและข้าวฟ่างในกลุ่ม C ในขณะที่มี GRF ข้าว 2 ตัวและ GRF ข้าวฟ่าง 1 ตัวในกลุ่ม B และ GRF ข้าวและข้าวฟ่างส่วนใหญ่จัดกลุ่มอยู่ในกิ่งเดียว ซึ่งบ่งชี้ว่า BjGRFs มีความเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับพืชใบเลี้ยงคู่ ในบรรดาทั้งหมด การศึกษาเชิงลึกที่สุดเกี่ยวกับการทำงานของ GRF ใน Arabidopsis thaliana เป็นพื้นฐานสำหรับการศึกษาการทำงานของ BjGRFs
ต้นไม้วิวัฒนาการของมัสตาร์ด ได้แก่ Brassica napus, Brassica napus, ข้าว, ข้าวฟ่าง และสมาชิกในวงศ์ Arabidopsis thaliana GRF
การวิเคราะห์ยีนที่ซ้ำกันในตระกูลมัสตาร์ด GRF เส้นสีเทาในพื้นหลังแสดงถึงบล็อกที่ซิงโครไนซ์ในจีโนมมัสตาร์ด เส้นสีแดงแสดงถึงคู่ของยีน BjGRF ที่ซ้ำกันแบบแบ่งส่วน
การแสดงออกของยีน BjGRF ภายใต้ภาวะเครียดจากภาวะแล้งในระยะใบที่สี่ ข้อมูล qRT-PCR แสดงอยู่ในตารางเสริม S5 ความแตกต่างที่สำคัญในข้อมูลจะระบุด้วยตัวอักษรพิมพ์เล็ก
เนื่องจากสภาพอากาศโลกยังคงเปลี่ยนแปลง การศึกษาว่าพืชรับมือกับความเครียดจากภัยแล้งได้อย่างไรและการปรับปรุงกลไกการทนทานต่อความเครียดของพืชได้กลายมาเป็นหัวข้อวิจัยที่ได้รับความสนใจอย่างมาก18 หลังจากภัยแล้ง โครงสร้างทางสัณฐานวิทยา การแสดงออกของยีน และกระบวนการเผาผลาญของพืชจะเปลี่ยนไป ซึ่งอาจนำไปสู่การหยุดสังเคราะห์แสงและการรบกวนการเผาผลาญ ส่งผลกระทบต่อผลผลิตและคุณภาพของพืช19,20,21 เมื่อพืชรับรู้สัญญาณภัยแล้ง พืชจะผลิตสารสื่อสัญญาณที่สอง เช่น Ca2+ และฟอสฟาติดิลอิโนซิทอล เพิ่มความเข้มข้นของไอออนแคลเซียมภายในเซลล์ และกระตุ้นเครือข่ายควบคุมของเส้นทางการฟอสโฟรีเลชันของโปรตีน22,23 โปรตีนเป้าหมายสุดท้ายมีส่วนเกี่ยวข้องโดยตรงกับการป้องกันของเซลล์หรือควบคุมการแสดงออกของยีนความเครียดที่เกี่ยวข้องผ่าน TF ช่วยเพิ่มความทนทานต่อความเครียดของพืช24,25 ดังนั้น TF จึงมีบทบาทสำคัญในการตอบสนองต่อความเครียดจากภัยแล้ง จากลำดับและคุณสมบัติการจับ DNA ของ TF ที่ตอบสนองต่อความเครียดจากภาวะแล้ง ทำให้สามารถแบ่ง TF ออกเป็นวงศ์ต่างๆ เช่น GRF, ERF, MYB, WRKY และวงศ์อื่นๆ26
กลุ่มยีน GRF เป็น TF เฉพาะพืชชนิดหนึ่งที่มีบทบาทสำคัญในหลายด้าน เช่น การเจริญเติบโต การพัฒนา การถ่ายทอดสัญญาณ และการตอบสนองการป้องกันตัวของพืช27 ตั้งแต่มีการระบุยีน GRF ตัวแรกใน O. sativa28 ยีน GRF จำนวนมากขึ้นเรื่อยๆ ได้รับการระบุในสปีชีส์ต่างๆ มากมาย และพบว่ามีผลต่อการเจริญเติบโต การพัฒนา และการตอบสนองต่อความเครียดของพืช8, 29, 30,31,32 ด้วยการเผยแพร่ลำดับจีโนม Brassica juncea ทำให้สามารถระบุกลุ่มยีน BjGRF ได้33 ในการศึกษานี้ ยีน BjGRF จำนวน 34 ยีนได้รับการระบุในจีโนมมัสตาร์ดทั้งหมด และตั้งชื่อว่า BjGRF01–BjGRF34 ตามตำแหน่งโครโมโซมของยีน ยีนทั้งหมดมีโดเมน QLQ และ WRC ที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้สูง การวิเคราะห์คุณสมบัติทางฟิสิกเคมีแสดงให้เห็นว่าความแตกต่างในจำนวนกรดอะมิโนและน้ำหนักโมเลกุลของโปรตีน BjGRF (ยกเว้น BjGRF28) ไม่สำคัญ ซึ่งบ่งชี้ว่าสมาชิกของตระกูล BjGRF อาจมีหน้าที่คล้ายกัน การวิเคราะห์โครงสร้างยีนแสดงให้เห็นว่ายีน BjGRF 64.7% มีเอกซอน 4 เอกซอน ซึ่งบ่งชี้ว่าโครงสร้างยีน BjGRF ได้รับการอนุรักษ์ไว้ค่อนข้างมากในวิวัฒนาการ แต่จำนวนเอกซอนในยีน BjGRF10, BjGRF16, BjGRP28 และ BjGRF29 มีจำนวนมากกว่า การศึกษาวิจัยแสดงให้เห็นว่าการเพิ่มหรือการลบเอกซอนหรืออินทรอนสามารถนำไปสู่ความแตกต่างในโครงสร้างและหน้าที่ของยีน จึงทำให้เกิดยีนใหม่34,35,36 ดังนั้น เราจึงคาดเดาว่าอินทรอนของ BjGRF สูญหายไประหว่างวิวัฒนาการ ซึ่งอาจทำให้หน้าที่ของยีนเปลี่ยนแปลงไป จากการศึกษาวิจัยที่มีอยู่ เรายังพบว่าจำนวนอินทรอนมีความเกี่ยวข้องกับการแสดงออกของยีนอีกด้วย เมื่อจำนวนอินทรอนในยีนมีขนาดใหญ่ ยีนนั้นจะตอบสนองต่อปัจจัยที่ไม่พึงประสงค์ต่างๆ ได้อย่างรวดเร็ว
การจำลองยีนเป็นปัจจัยสำคัญในการวิวัฒนาการของจีโนมและพันธุกรรม37 การศึกษาที่เกี่ยวข้องได้แสดงให้เห็นว่าการจำลองยีนไม่เพียงแต่เพิ่มจำนวนยีน GRF เท่านั้น แต่ยังทำหน้าที่เป็นวิธีการสร้างยีนใหม่เพื่อช่วยให้พืชปรับตัวเข้ากับสภาพแวดล้อมที่ไม่เอื้ออำนวยต่างๆ38 การศึกษาครั้งนี้พบคู่ยีนที่ซ้ำกันทั้งหมด 48 คู่ ซึ่งทั้งหมดเป็นการจำลองแบบแบ่งส่วน ซึ่งบ่งชี้ว่าการจำลองแบบแบ่งส่วนเป็นกลไกหลักในการเพิ่มจำนวนยีนในวงศ์นี้ มีรายงานในเอกสารว่าการจำลองแบบแบ่งส่วนสามารถส่งเสริมการขยายตัวของสมาชิกในวงศ์ยีน GRF ได้อย่างมีประสิทธิภาพใน Arabidopsis และสตรอเบอร์รี่ และไม่พบการจำลองแบบคู่ขนานของวงศ์ยีนนี้ในสปีชีส์ใดๆ27,39 ผลการศึกษาครั้งนี้สอดคล้องกับการศึกษาที่มีอยู่เกี่ยวกับวงศ์ Arabidopsis thaliana และสตรอเบอร์รี่ ซึ่งบ่งชี้ว่าวงศ์ GRF สามารถเพิ่มจำนวนยีนและสร้างยีนใหม่ได้ผ่านการจำลองแบบแบ่งส่วนในพืชต่างๆ
ในการศึกษาครั้งนี้ พบยีน BjGRF ทั้งหมด 34 ยีนในมัสตาร์ด ซึ่งแบ่งออกเป็น 3 วงศ์ย่อย ยีนเหล่านี้แสดงรูปแบบยีนและโครงสร้างยีนที่อนุรักษ์ไว้คล้ายกัน การวิเคราะห์ความสัมพันธ์เชิงเส้นตรงเผยให้เห็นคู่ซ้ำของส่วนต่างๆ 48 คู่ในมัสตาร์ด บริเวณโปรโมเตอร์ BjGRF ประกอบด้วยองค์ประกอบที่ทำหน้าที่แบบซิสซึ่งเกี่ยวข้องกับการตอบสนองต่อแสง การตอบสนองของฮอร์โมน การตอบสนองต่อความเครียดจากสิ่งแวดล้อม และการเจริญเติบโตและการพัฒนา ตรวจพบการแสดงออกของยีน BjGRF จำนวน 34 ยีนในระยะต้นกล้ามัสตาร์ด (ราก ลำต้น ใบ) และรูปแบบการแสดงออกของยีน BjGRF จำนวน 10 ยีนภายใต้สภาวะแห้งแล้ง พบว่ารูปแบบการแสดงออกของยีน BjGRF ภายใต้สภาวะแห้งแล้งมีความคล้ายคลึงกันและอาจคล้ายคลึงกัน การมีส่วนร่วมในการควบคุมแรงบังคับจากภัยแล้ง ยีน BjGRF03 และ BjGRF32 อาจมีบทบาทเชิงบวกในการควบคุมความเครียดจากภัยแล้ง ในขณะที่ยีน BjGRF06 และ BjGRF23 มีบทบาทในความเครียดจากภัยแล้งในฐานะยีนเป้าหมายของ miR396 โดยรวมแล้ว การศึกษาของเราให้พื้นฐานทางชีววิทยาสำหรับการค้นพบหน้าที่ของยีน BjGRF ในพืชตระกูล Brassicaceae ในอนาคต
เมล็ดมัสตาร์ดที่ใช้ในการทดลองนี้ได้รับจากสถาบันวิจัยเมล็ดพันธุ์น้ำมันกุ้ยโจว วิทยาลัยวิทยาศาสตร์การเกษตรกุ้ยโจว เลือกเมล็ดพันธุ์ทั้งหมดแล้วปลูกในดิน (วัสดุปลูก: ดิน = 3:1) และเก็บราก ลำต้น และใบหลังจากระยะใบสี่ใบแล้ว ต้นไม้ได้รับการบำบัดด้วย PEG 6000 20% เพื่อจำลองภาวะแห้งแล้ง และเก็บใบหลังจาก 0, 3, 6, 12 และ 24 ชั่วโมง ตัวอย่างพืชทั้งหมดถูกแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวทันที จากนั้นจึงเก็บไว้ในช่องแช่แข็งที่อุณหภูมิ -80°C สำหรับการทดสอบครั้งต่อไป
ข้อมูลทั้งหมดที่ได้รับหรือวิเคราะห์ในระหว่างการศึกษานี้จะรวมอยู่ในบทความที่ตีพิมพ์และไฟล์ข้อมูลเพิ่มเติม