การระบุและการวิเคราะห์การแสดงออกของยีนควบคุมการเจริญเติบโตของมัสตาร์ดทั่วทั้งจีโนมภายใต้สภาวะแห้งแล้ง

การกระจายตัวของปริมาณน้ำฝนตามฤดูกาลในมณฑลกุ้ยโจวไม่สม่ำเสมอ โดยมีปริมาณน้ำฝนมากในฤดูใบไม้ผลิและฤดูร้อน แต่ต้นกล้าเรพซีดมีความอ่อนไหวต่อภาวะแห้งแล้งในฤดูใบไม้ร่วงและฤดูหนาว ซึ่งส่งผลกระทบอย่างร้ายแรงต่อผลผลิต มัสตาร์ดเป็นพืชน้ำมันชนิดพิเศษที่ปลูกกันมากในมณฑลกุ้ยโจว มีความทนทานต่อความแห้งแล้งสูงและสามารถปลูกได้ในพื้นที่ภูเขา เป็นแหล่งทรัพยากรที่อุดมสมบูรณ์ของยีนต้านทานความแห้งแล้ง การค้นพบยีนต้านทานความแห้งแล้งมีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการปรับปรุงพันธุ์มัสตาร์ดและนวัตกรรมในทรัพยากรเชื้อพันธุ์ ตระกูล GRF มีบทบาทสำคัญในการเจริญเติบโตและพัฒนาการของพืชและการตอบสนองต่อภาวะแห้งแล้ง ปัจจุบันพบยีน GRF ใน Arabidopsis 2, ข้าว (Oryza sativa) 12, เรพซีด 13, ฝ้าย (Gossypium hirsutum) 14 และข้าวสาลี (Triticum) มีการค้นพบยีน GRF ในพืชตระกูลถั่วหลายชนิด เช่น ผักกาดหอม (Aestivum)15, ข้าวฟ่าง (Setaria italica)16 และ Brassica17 แต่ยังไม่มีรายงานการตรวจพบยีน GRF ในมัสตาร์ด ในการศึกษาครั้งนี้ ได้ทำการระบุยีนตระกูล GRF ในมัสตาร์ดในระดับจีโนม และวิเคราะห์ลักษณะทางกายภาพและเคมี ความสัมพันธ์เชิงวิวัฒนาการ ความเหมือนกัน ลวดลายที่อนุรักษ์ไว้ โครงสร้างยีน การเพิ่มจำนวนยีน องค์ประกอบซิส และระยะต้นกล้า (ระยะสี่ใบ) นอกจากนี้ยังได้วิเคราะห์รูปแบบการแสดงออกภายใต้สภาวะแห้งแล้งอย่างครอบคลุม เพื่อเป็นพื้นฐานทางวิทยาศาสตร์สำหรับการศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับหน้าที่ที่เป็นไปได้ของยีน BjGRF ในการตอบสนองต่อความแห้งแล้ง และเพื่อจัดหายีนเป้าหมายสำหรับการปรับปรุงพันธุ์มัสตาร์ดให้ทนแล้ง
มีการระบุยีน BjGRF จำนวน 34 ยีนในจีโนมของ Brassica juncea โดยใช้การค้นหา HMMER สองครั้ง ซึ่งทั้งหมดมีโดเมน QLQ และ WRC ลำดับ CDS ของยีน BjGRF ที่ระบุได้แสดงอยู่ในตารางเสริม S1 BjGRF01–BjGRF34 ได้รับการตั้งชื่อตามตำแหน่งบนโครโมโซม คุณสมบัติทางกายภาพและเคมีของตระกูลนี้บ่งชี้ว่าความยาวของกรดอะมิโนมีความแปรผันสูง ตั้งแต่ 261 กรดอะมิโน (BjGRF19) ถึง 905 กรดอะมิโน (BjGRF28) จุดไอโซอิเล็กทริกของ BjGRF อยู่ในช่วง 6.19 (BjGRF02) ถึง 9.35 (BjGRF03) โดยมีค่าเฉลี่ย 8.33 และ 88.24% ของ BjGRF เป็นโปรตีนพื้นฐาน ช่วงน้ำหนักโมเลกุลที่คาดการณ์ของ BjGRF อยู่ระหว่าง 29.82 kDa (BjGRF19) ถึง 102.90 kDa (BjGRF28); ดัชนีความไม่เสถียรของโปรตีน BjGRF อยู่ในช่วง 51.13 (BjGRF08) ถึง 78.24 (BjGRF19) ซึ่งทั้งหมดมีค่ามากกว่า 40 แสดงว่าดัชนีกรดไขมันอยู่ในช่วง 43.65 (BjGRF01) ถึง 78.78 (BjGRF22) ค่าความชอบน้ำเฉลี่ย (GRAVY) อยู่ในช่วง -1.07 (BjGRF31) ถึง -0.45 (BjGRF22) โปรตีน BjGRF ที่ชอบน้ำทั้งหมดมีค่า GRAVY เป็นลบ ซึ่งอาจเกิดจากการขาดคุณสมบัติไม่ชอบน้ำของสารตกค้าง การทำนายตำแหน่งภายในเซลล์แสดงให้เห็นว่าโปรตีนที่เข้ารหัสโดย BjGRF จำนวน 31 ตัวสามารถพบได้ในนิวเคลียส BjGRF04 สามารถพบได้ในเพอร์ออกซิโซม BjGRF25 สามารถพบได้ในไซโตพลาสม และ BjGRF28 สามารถพบได้ในคลอโรพลาสต์ (ตารางที่ 1) ซึ่งบ่งชี้ว่า BjGRF อาจพบได้ในนิวเคลียสและมีบทบาทสำคัญในการควบคุมในฐานะปัจจัยการถอดรหัส
การวิเคราะห์ทางวิวัฒนาการของตระกูล GRF ในสิ่งมีชีวิตต่างชนิดกันสามารถช่วยในการศึกษาหน้าที่ของยีนได้ ดังนั้น จึงได้ดาวน์โหลดลำดับกรดอะมิโนแบบเต็มความยาวของ GRF จากเรพซีด 35 ตัว หัวผักกาด 16 ตัว ข้าว 12 ตัว ข้าวฟ่าง 10 ตัว และอะราบิโดปซิส 9 ตัว และสร้างแผนภูมิวิวัฒนาการโดยอิงจากยีน BjGRF ที่ระบุได้ 34 ตัว (รูปที่ 1) สามกลุ่มย่อยประกอบด้วยจำนวนสมาชิกที่แตกต่างกัน โดย GRF TF จำนวน 116 ตัวถูกแบ่งออกเป็นสามกลุ่มย่อยที่แตกต่างกัน (กลุ่ม A~C) ซึ่งประกอบด้วย GRF ร้อยละ 59 (50.86%), 34 (29.31%) และ 23 (19.83%) ตามลำดับ ในจำนวนนี้ สมาชิกในตระกูล BjGRF จำนวน 34 ตัวกระจายอยู่ใน 3 กลุ่มย่อย ได้แก่ 13 ตัวในกลุ่ม A (38.24%), 12 ตัวในกลุ่ม B (35.29%) และ 9 ตัวในกลุ่ม C (26.47%) ในกระบวนการเพิ่มจำนวนโครโมโซมของมัสตาร์ด จำนวนยีน BjGRF ในกลุ่มย่อยต่างๆ จะแตกต่างกัน และอาจเกิดการเพิ่มจำนวนและการสูญเสียยีนได้ ที่น่าสังเกตคือ ไม่มีการกระจายตัวของยีน GRF ของข้าวและข้าวฟ่างในกลุ่ม C ในขณะที่มียีน GRF ของข้าว 2 ยีน และยีน GRF ของข้าวฟ่าง 1 ยีนในกลุ่ม B และยีน GRF ของข้าวและข้าวฟ่างส่วนใหญ่รวมกลุ่มกันอยู่ในกิ่งเดียวกัน ซึ่งบ่งชี้ว่า BjGRF มีความสัมพันธ์ใกล้ชิดกับพืชใบเลี้ยงคู่ ในบรรดาการศึกษาเชิงลึกเกี่ยวกับหน้าที่ของ GRF ใน Arabidopsis thaliana นั้น เป็นพื้นฐานสำหรับการศึกษาหน้าที่ของ BjGRF
แผนภูมิวิวัฒนาการของมัสตาร์ด ซึ่งรวมถึง Brassica napus, ข้าว, ข้าวฟ่าง และสมาชิกในวงศ์ Arabidopsis thaliana GRF
การวิเคราะห์ยีนซ้ำในกลุ่มยีน GRF ของมัสตาร์ด เส้นสีเทาในพื้นหลังแสดงถึงบล็อกที่ซิงโครไนซ์กันในจีโนมของมัสตาร์ด เส้นสีแดงแสดงถึงคู่ของส่วนที่ซ้ำกันของยีน BjGRF
การแสดงออกของยีน BjGRF ภายใต้สภาวะความเครียดจากภัยแล้งในระยะใบที่สี่ ข้อมูล qRT-PCR แสดงอยู่ในตารางเสริม S5 ความแตกต่างที่มีนัยสำคัญในข้อมูลแสดงด้วยตัวอักษรตัวเล็ก
เนื่องจากสภาพภูมิอากาศโลกเปลี่ยนแปลงอย่างต่อเนื่อง การศึกษาว่าพืชรับมือกับความเครียดจากภัยแล้งอย่างไร และการปรับปรุงกลไกการทนทานต่อภัยแล้งจึงกลายเป็นหัวข้อวิจัยที่ได้รับความสนใจอย่างมาก18 หลังภัยแล้ง โครงสร้างทางสัณฐานวิทยา การแสดงออกของยีน และกระบวนการเผาผลาญของพืชจะเปลี่ยนแปลงไป ซึ่งอาจนำไปสู่การหยุดชะงักของการสังเคราะห์แสงและความผิดปกติของการเผาผลาญ ส่งผลกระทบต่อผลผลิตและคุณภาพของพืชผล19,20,21 เมื่อพืชรับรู้สัญญาณภัยแล้ง พวกมันจะผลิตสารสื่อประสาทรอง เช่น Ca2+ และฟอสฟาติดิลอิโนซิทอล เพิ่มความเข้มข้นของไอออนแคลเซียมภายในเซลล์ และกระตุ้นเครือข่ายควบคุมของเส้นทางการฟอสโฟรีเลชันของโปรตีน22,23 โปรตีนเป้าหมายสุดท้ายมีส่วนเกี่ยวข้องโดยตรงกับการป้องกันเซลล์หรือควบคุมการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับความเครียดผ่าน TF ซึ่งช่วยเพิ่มความทนทานของพืชต่อความเครียด24,25 ดังนั้น TF จึงมีบทบาทสำคัญในการตอบสนองต่อความเครียดจากภัยแล้ง ตามลำดับและคุณสมบัติการจับกับ DNA ของ TF ที่ตอบสนองต่อความเครียดจากภัยแล้ง TF สามารถแบ่งออกเป็นตระกูลต่างๆ ได้ เช่น GRF, ERF, MYB, WRKY และตระกูลอื่นๆ26
ยีนตระกูล GRF เป็น TF เฉพาะพืชชนิดหนึ่งที่มีบทบาทสำคัญในด้านต่างๆ เช่น การเจริญเติบโต การพัฒนา การส่งสัญญาณ และการตอบสนองต่อการป้องกันของพืช27 นับตั้งแต่มีการระบุยีน GRF ตัวแรกใน O. sativa28 ก็มีการระบุยีน GRF เพิ่มมากขึ้นเรื่อยๆ ในหลายๆ สปีชีส์ และแสดงให้เห็นว่ามีผลต่อการเจริญเติบโต การพัฒนา และการตอบสนองต่อความเครียดของพืช8, 29, 30,31,32 ด้วยการตีพิมพ์ลำดับจีโนมของ Brassica juncea ทำให้สามารถระบุยีนตระกูล BjGRF ได้33 ในการศึกษานี้ มีการระบุยีน BjGRF จำนวน 34 ยีนในจีโนมมัสตาร์ดทั้งหมด และตั้งชื่อว่า BjGRF01–BjGRF34 ตามตำแหน่งบนโครโมโซม ยีนทั้งหมดเหล่านี้มีโดเมน QLQ และ WRC ที่มีการอนุรักษ์สูง การวิเคราะห์คุณสมบัติทางกายภาพและเคมีแสดงให้เห็นว่าความแตกต่างในจำนวนกรดอะมิโนและน้ำหนักโมเลกุลของโปรตีน BjGRF (ยกเว้น BjGRF28) ไม่มีความสำคัญอย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งบ่งชี้ว่าสมาชิกในตระกูล BjGRF อาจมีหน้าที่คล้ายคลึงกัน การวิเคราะห์โครงสร้างยีนแสดงให้เห็นว่า 64.7% ของยีน BjGRF มี 4 เอ็กซอน ซึ่งบ่งชี้ว่าโครงสร้างยีน BjGRF ค่อนข้างคงที่ในวิวัฒนาการ แต่จำนวนเอ็กซอนในยีน BjGRF10, BjGRF16, BjGRP28 และ BjGRF29 มีจำนวนมากกว่า การศึกษาต่างๆ แสดงให้เห็นว่าการเพิ่มหรือการลบเอ็กซอนหรืออินทรอนสามารถนำไปสู่ความแตกต่างในโครงสร้างและหน้าที่ของยีน ทำให้เกิดยีนใหม่ขึ้น34,35,36 ดังนั้นเราจึงคาดการณ์ว่าอินทรอนของ BjGRF สูญหายไปในระหว่างวิวัฒนาการ ซึ่งอาจทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในหน้าที่ของยีน สอดคล้องกับการศึกษาที่มีอยู่ เรายังพบว่าจำนวนอินทรอนมีความสัมพันธ์กับการแสดงออกของยีน เมื่อจำนวนอินทรอนในยีนมีมาก ยีนนั้นจะสามารถตอบสนองต่อปัจจัยที่ไม่พึงประสงค์ต่างๆ ได้อย่างรวดเร็ว
การเพิ่มจำนวนยีนเป็นปัจจัยสำคัญในการวิวัฒนาการของจีโนมและพันธุกรรม37 การศึกษาที่เกี่ยวข้องแสดงให้เห็นว่าการเพิ่มจำนวนยีนไม่เพียงแต่เพิ่มจำนวนยีน GRF เท่านั้น แต่ยังทำหน้าที่เป็นวิธีการสร้างยีนใหม่เพื่อช่วยให้พืชปรับตัวเข้ากับสภาพแวดล้อมที่ไม่เอื้ออำนวยต่างๆ ได้อีกด้วย38 ในการศึกษานี้พบยีนคู่ที่เพิ่มจำนวนทั้งหมด 48 คู่ ซึ่งทั้งหมดเป็นการเพิ่มจำนวนแบบแบ่งส่วน แสดงให้เห็นว่าการเพิ่มจำนวนแบบแบ่งส่วนเป็นกลไกหลักในการเพิ่มจำนวนยีนในกลุ่มนี้ มีรายงานในวรรณกรรมว่าการเพิ่มจำนวนแบบแบ่งส่วนสามารถส่งเสริมการขยายตัวของสมาชิกในกลุ่มยีน GRF ใน Arabidopsis และสตรอว์เบอร์รีได้อย่างมีประสิทธิภาพ และไม่พบการเพิ่มจำนวนแบบเรียงต่อกันของกลุ่มยีนนี้ในสายพันธุ์ใดๆ เลย27,39 ผลการศึกษาในครั้งนี้สอดคล้องกับการศึกษาที่มีอยู่เกี่ยวกับกลุ่มยีน Arabidopsis thaliana และสตรอว์เบอร์รี ซึ่งชี้ให้เห็นว่ากลุ่มยีน GRF สามารถเพิ่มจำนวนยีนและสร้างยีนใหม่ผ่านการเพิ่มจำนวนแบบแบ่งส่วนในพืชชนิดต่างๆ ได้
ในการศึกษาครั้งนี้ พบยีน BjGRF ทั้งหมด 34 ยีนในต้นมัสตาร์ด ซึ่งแบ่งออกเป็น 3 กลุ่มย่อย ยีนเหล่านี้แสดงให้เห็นถึงลวดลายอนุรักษ์และโครงสร้างยีนที่คล้ายคลึงกัน การวิเคราะห์ความสัมพันธ์เชิงเส้นตรงเผยให้เห็นการทำซ้ำของส่วนต่างๆ จำนวน 48 คู่ในต้นมัสตาร์ด บริเวณโปรโมเตอร์ของยีน BjGRF ประกอบด้วยองค์ประกอบที่ออกฤทธิ์แบบซิส ซึ่งเกี่ยวข้องกับการตอบสนองต่อแสง การตอบสนองต่อฮอร์โมน การตอบสนองต่อความเครียดจากสิ่งแวดล้อม และการเจริญเติบโตและการพัฒนา การแสดงออกของยีน BjGRF ทั้ง 34 ยีนถูกตรวจพบในระยะต้นกล้ามัสตาร์ด (ราก ลำต้น ใบ) และรูปแบบการแสดงออกของยีน BjGRF จำนวน 10 ยีนภายใต้สภาวะแห้งแล้ง พบว่ารูปแบบการแสดงออกของยีน BjGRF ภายใต้ความเครียดจากความแห้งแล้งนั้นคล้ายคลึงกัน และอาจมีส่วนเกี่ยวข้องในการควบคุมการบังคับจากความแห้งแล้ง ยีน BjGRF03 และ BjGRF32 อาจมีบทบาทในการควบคุมเชิงบวกต่อภาวะแห้งแล้ง ในขณะที่ BjGRF06 และ BjGRF23 มีบทบาทในภาวะแห้งแล้งในฐานะยีนเป้าหมายของ miR396 โดยรวมแล้ว การศึกษาของเราให้พื้นฐานทางชีววิทยาสำหรับการค้นพบหน้าที่ของยีน BjGRF ในพืชวงศ์ Brassicaceae ในอนาคต
เมล็ดมัสตาร์ดที่ใช้ในการทดลองนี้ได้รับจากสถาบันวิจัยเมล็ดพืชน้ำมันกุ้ยโจว สถาบันวิทยาศาสตร์การเกษตรกุ้ยโจว คัดเลือกเมล็ดที่สมบูรณ์และปลูกในดิน (วัสดุปลูก:ดิน = 3:1) และเก็บราก ลำต้น และใบเมื่อต้นพืชมีใบครบ 4 ใบ จากนั้นทำการทดลองโดยให้พืชสัมผัสกับสาร PEG 6000 ความเข้มข้น 20% เพื่อจำลองสภาวะแห้งแล้ง และเก็บใบหลังจาก 0, 3, 6, 12 และ 24 ชั่วโมง ตัวอย่างพืชทั้งหมดถูกแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวทันที แล้วเก็บไว้ในช่องแช่แข็งที่อุณหภูมิ -80°C เพื่อทำการทดสอบต่อไป
ข้อมูลทั้งหมดที่ได้รับหรือวิเคราะห์ในระหว่างการศึกษาครั้งนี้รวมอยู่ในบทความที่ตีพิมพ์และไฟล์ข้อมูลเพิ่มเติมแล้ว