การระบุและวิเคราะห์การแสดงออกของปัจจัยควบคุมการเจริญเติบโตของมัสตาร์ดทั่วทั้งจีโนมภายใต้สภาวะภัยแล้ง

การกระจายตัวของปริมาณน้ำฝนตามฤดูกาลในมณฑลกุ้ยโจวมีความไม่สม่ำเสมอ โดยมีปริมาณน้ำฝนมากกว่าในฤดูใบไม้ผลิและฤดูร้อน แต่ต้นกล้าเรพซีดมีความเสี่ยงต่อภาวะแห้งแล้งในฤดูใบไม้ร่วงและฤดูหนาว ซึ่งส่งผลกระทบอย่างรุนแรงต่อผลผลิต มัสตาร์ดเป็นพืชน้ำมันชนิดพิเศษที่ปลูกในมณฑลกุ้ยโจวเป็นหลัก ทนทานต่อภาวะแห้งแล้งได้ดีและสามารถปลูกได้ในพื้นที่ภูเขา เป็นแหล่งทรัพยากรยีนที่ต้านทานภาวะแห้งแล้งอย่างอุดมสมบูรณ์ การค้นพบยีนต้านทานภาวะแห้งแล้งมีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการพัฒนาพันธุ์มัสตาร์ดและนวัตกรรมในแหล่งพันธุกรรม ตระกูล GRF มีบทบาทสำคัญในการเจริญเติบโตและพัฒนาการของพืช และการตอบสนองต่อภาวะแห้งแล้ง ปัจจุบันพบยีน GRF ใน Arabidopsis 2, ข้าว (Oryza sativa) 12, เรพซีด 13, ฝ้าย (Gossypium hirsutum) 14 และข้าวสาลี (Triticum) ยีน GRF ของมัสตาร์ด (Aestivum)15, ข้าวฟ่างมุก (Setaria italica)16 และ Brassica17 แต่ยังไม่มีรายงานการตรวจพบยีน GRF ในมัสตาร์ด ในการศึกษานี้ ยีนตระกูล GRF ของมัสตาร์ดถูกระบุในระดับจีโนม และวิเคราะห์ลักษณะทางกายภาพและทางเคมี ความสัมพันธ์เชิงวิวัฒนาการ ความคล้ายคลึงกัน ลวดลายอนุรักษ์ โครงสร้างยีน การจำลองยีน องค์ประกอบซิส และระยะต้นกล้า (ระยะสี่ใบ) รูปแบบการแสดงออกภายใต้ภาวะเครียดจากความแห้งแล้งได้รับการวิเคราะห์อย่างครอบคลุม เพื่อเป็นพื้นฐานทางวิทยาศาสตร์สำหรับการศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับหน้าที่ที่เป็นไปได้ของยีน BjGRF ในการตอบสนองต่อความแห้งแล้ง และเพื่อจัดหายีนที่เหมาะสมสำหรับการปรับปรุงพันธุ์มัสตาร์ดที่ทนแล้ง
ยีน BjGRF จำนวน 34 ยีนถูกระบุในจีโนม Brassica juncea โดยใช้การค้นหา HMMER สองครั้ง ซึ่งทั้งหมดมีโดเมน QLQ และ WRC ลำดับ CDS ของยีน BjGRF ที่ระบุได้แสดงไว้ในตารางเสริม S1 BjGRF01–BjGRF34 ได้รับการตั้งชื่อตามตำแหน่งบนโครโมโซม คุณสมบัติทางฟิสิกเคมีของยีนตระกูลนี้บ่งชี้ว่าความยาวของกรดอะมิโนมีความผันแปรอย่างมาก โดยมีตั้งแต่ 261 aa (BjGRF19) ถึง 905 aa (BjGRF28) จุดไอโซอิเล็กทริกของ BjGRF อยู่ในช่วงตั้งแต่ 6.19 (BjGRF02) ถึง 9.35 (BjGRF03) โดยมีค่าเฉลี่ยอยู่ที่ 8.33 และ 88.24% ของ BjGRF เป็นโปรตีนเบส ช่วงน้ำหนักโมเลกุลที่คาดการณ์ของ BjGRF อยู่ระหว่าง 29.82 kDa (BjGRF19) ถึง 102.90 kDa (BjGRF28); ดัชนีความไม่เสถียรของโปรตีน BjGRF อยู่ระหว่าง 51.13 (BjGRF08) ถึง 78.24 (BjGRF19) โดยทั้งหมดมีค่ามากกว่า 40 ซึ่งบ่งชี้ว่าดัชนีกรดไขมันอยู่ระหว่าง 43.65 (BjGRF01) ถึง 78.78 (BjGRF22) ค่าความชอบน้ำโดยเฉลี่ย (GRAVY) อยู่ระหว่าง -1.07 (BjGRF31) ถึง -0.45 (BjGRF22) โปรตีน BjGRF ที่ชอบน้ำทั้งหมดมีค่า GRAVY เป็นลบ ซึ่งอาจเกิดจากการขาดคุณสมบัติไม่ชอบน้ำที่เกิดจากสารตกค้าง การทำนายตำแหน่งย่อยของเซลล์แสดงให้เห็นว่าโปรตีนที่เข้ารหัส BjGRF จำนวน 31 ตัวสามารถอยู่ในนิวเคลียส BjGRF04 สามารถอยู่ในเพอร์ออกซิโซม BjGRF25 สามารถอยู่ในไซโทพลาซึม และ BjGRF28 สามารถอยู่ในคลอโรพลาสต์ได้ (ตารางที่ 1) ซึ่งบ่งชี้ว่า BjGRF อาจอยู่ในนิวเคลียสและมีบทบาทสำคัญในการควบคุมเป็นปัจจัยการถอดรหัส
การวิเคราะห์วิวัฒนาการทางพันธุกรรมของวงศ์ GRF ในสปีชีส์ต่างๆ สามารถช่วยศึกษาการทำงานของยีนได้ ดังนั้น จึงได้ดาวน์โหลดลำดับกรดอะมิโนแบบเต็มความยาวของ GRF จากเรพซีด 35 ชนิด หัวผักกาด 16 ชนิด ข้าว 12 ชนิด ข้าวฟ่าง 10 ชนิด และ Arabidopsis 9 ชนิด และสร้างแผนภูมิวิวัฒนาการทางพันธุกรรมโดยอ้างอิงจากยีน BjGRF ที่ระบุได้ 34 ยีน (รูปที่ 1) วงศ์ย่อยทั้งสามมีจำนวนสมาชิกที่แตกต่างกัน โดย GRF TF จำนวน 116 ตัว แบ่งออกเป็น 3 วงศ์ย่อย (กลุ่ม A~C) ประกอบด้วย GRF 59 ตัว (50.86%), 34 ตัว (29.31%) และ 23 ตัว (19.83)% ตามลำดับ ในจำนวนนี้ มีสมาชิกวงศ์ BjGRF จำนวน 34 ตัว กระจายอยู่ใน 3 วงศ์ย่อย ได้แก่ กลุ่ม A จำนวน 13 ตัว (38.24%) กลุ่ม B จำนวน 12 ตัว (35.29%) และกลุ่ม C จำนวน 9 ตัว (26.47%) ในกระบวนการโพลีพลอยด์ของมัสตาร์ด จำนวนยีน BjGRFs ในวงศ์ย่อยต่างๆ จะแตกต่างกัน และอาจเกิดการเพิ่มจำนวนและการสูญเสียยีนได้ ที่น่าสังเกตคือ GRF ของข้าวและข้าวฟ่างในกลุ่ม C ไม่มีการกระจายตัว ในขณะที่ GRF ของข้าว 2 ตัวและ GRF ของข้าวฟ่าง 1 ตัวในกลุ่ม B และ GRF ของข้าวและข้าวฟ่างส่วนใหญ่จัดอยู่ในกลุ่มเดียวกัน ซึ่งบ่งชี้ว่า BjGRFs มีความสัมพันธ์ใกล้ชิดกับพืชใบเลี้ยงคู่ ในบรรดากลุ่มเหล่านี้ การศึกษาเชิงลึกที่สุดเกี่ยวกับหน้าที่ของ GRF ใน Arabidopsis thaliana เป็นพื้นฐานสำหรับการศึกษาการทำงานของ BjGRFs
ต้นไม้วิวัฒนาการของมัสตาร์ด ได้แก่ Brassica napus, Brassica napus, ข้าว, ข้าวฟ่าง และสมาชิกของวงศ์ Arabidopsis thaliana GRF
การวิเคราะห์ยีนที่ซ้ำกันในตระกูลมัสตาร์ด GRF เส้นสีเทาในพื้นหลังแสดงถึงบล็อกที่ซิงโครไนซ์กันในจีโนมมัสตาร์ด เส้นสีแดงแสดงถึงคู่ของยีน BjGRF ที่ซ้ำกันแบบแบ่งส่วน
การแสดงออกของยีน BjGRF ภายใต้ภาวะเครียดจากภาวะแล้งที่ระยะใบที่สี่ ข้อมูล qRT-PCR แสดงอยู่ในตารางเสริม S5 ความแตกต่างที่สำคัญของข้อมูลแสดงด้วยอักษรตัวพิมพ์เล็ก
ในขณะที่สภาพภูมิอากาศโลกยังคงเปลี่ยนแปลง การศึกษาว่าพืชรับมือกับความเครียดจากภัยแล้งและการปรับปรุงกลไกการทนทานต่อความเครียดของพืชอย่างไรจึงกลายเป็นหัวข้อวิจัยที่ได้รับความสนใจอย่างมาก18 หลังจากภัยแล้ง โครงสร้างทางสัณฐานวิทยา การแสดงออกของยีน และกระบวนการเผาผลาญของพืชจะเปลี่ยนแปลงไป ซึ่งอาจนำไปสู่การหยุดการสังเคราะห์แสงและการรบกวนการเผาผลาญ ซึ่งส่งผลกระทบต่อผลผลิตและคุณภาพของพืช19,20,21 เมื่อพืชรับรู้สัญญาณภัยแล้ง พืชจะผลิตสารสื่อสัญญาณที่สอง เช่น Ca2+ และฟอสฟาติดิลอิโนซิทอล เพิ่มความเข้มข้นของแคลเซียมไอออนภายในเซลล์ และกระตุ้นเครือข่ายควบคุมของวิถีฟอสโฟรีเลชันของโปรตีน22,23 โปรตีนเป้าหมายสุดท้ายมีส่วนเกี่ยวข้องโดยตรงกับการป้องกันตัวเองของเซลล์หรือควบคุมการแสดงออกของยีนความเครียดที่เกี่ยวข้องผ่านโปรตีนฟอสโฟรีเลชัน (TFs) ซึ่งช่วยเพิ่มความทนทานต่อความเครียดของพืช24,25 ดังนั้น TFs จึงมีบทบาทสำคัญในการตอบสนองต่อความเครียดจากภัยแล้ง ตามลำดับและคุณสมบัติในการจับ DNA ของ TF ที่ตอบสนองต่อความเครียดจากความแห้งแล้ง TF สามารถแบ่งออกได้เป็นวงศ์ต่างๆ เช่น GRF, ERF, MYB, WRKY และวงศ์อื่นๆ26
ยีนตระกูล GRF เป็นยีนจำเพาะต่อพืชชนิดหนึ่งที่มีบทบาทสำคัญหลายประการ เช่น การเจริญเติบโต การพัฒนา การถ่ายทอดสัญญาณ และการตอบสนองการป้องกันตนเองของพืช27 นับตั้งแต่พบยีน GRF ตัวแรกใน O. sativa28 ยีน GRF จำนวนมากขึ้นเรื่อยๆ ได้รับการระบุในพืชหลายชนิด และพบว่ามีผลต่อการเจริญเติบโต การพัฒนา และการตอบสนองต่อความเครียดของพืช8, 29, 30, 31, 32 เมื่อมีการเผยแพร่ลำดับจีโนมของ Brassica juncea ทำให้สามารถระบุยีนตระกูล BjGRF ได้33 ในการศึกษานี้ พบยีน BjGRF จำนวน 34 ยีนในจีโนมมัสตาร์ดทั้งหมด และตั้งชื่อยีน BjGRF01–BjGRF34 ตามตำแหน่งโครโมโซม ยีนทั้งหมดมีโดเมน QLQ และ WRC ที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้สูง การวิเคราะห์คุณสมบัติทางเคมีฟิสิกส์แสดงให้เห็นว่าความแตกต่างของจำนวนกรดอะมิโนและน้ำหนักโมเลกุลของโปรตีน BjGRF (ยกเว้น BjGRF28) ไม่มีนัยสำคัญ ซึ่งบ่งชี้ว่าสมาชิกในตระกูล BjGRF อาจมีหน้าที่คล้ายคลึงกัน การวิเคราะห์โครงสร้างยีนแสดงให้เห็นว่า 64.7% ของยีน BjGRF มี 4 เอ็กซอน ซึ่งบ่งชี้ว่าโครงสร้างของยีน BjGRF ค่อนข้างอนุรักษ์ไว้ในวิวัฒนาการ แต่จำนวนเอ็กซอนในยีน BjGRF10, BjGRF16, BjGRP28 และ BjGRF29 มีจำนวนมากกว่า การศึกษาแสดงให้เห็นว่าการเพิ่มหรือการลบเอ็กซอนหรืออินทรอนสามารถนำไปสู่ความแตกต่างในโครงสร้างและหน้าที่ของยีน ส่งผลให้เกิดยีนใหม่34, 35, 36 ดังนั้น เราจึงสันนิษฐานว่าอินทรอนของ BjGRF ได้สูญหายไปในระหว่างวิวัฒนาการ ซึ่งอาจทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในหน้าที่ของยีน สอดคล้องกับการศึกษาที่มีอยู่ เรายังพบว่าจำนวนอินทรอนเกี่ยวข้องกับการแสดงออกของยีน เมื่อจำนวนอินทรอนในยีนมีมาก ยีนอาจตอบสนองต่อปัจจัยที่ไม่พึงประสงค์ต่างๆ ได้อย่างรวดเร็ว
การจำลองยีนเป็นปัจจัยสำคัญในวิวัฒนาการทางพันธุกรรมและจีโนม37 การศึกษาที่เกี่ยวข้องแสดงให้เห็นว่าการจำลองยีนไม่เพียงแต่เพิ่มจำนวนยีน GRF เท่านั้น แต่ยังเป็นวิธีการสร้างยีนใหม่เพื่อช่วยให้พืชปรับตัวเข้ากับสภาพแวดล้อมที่ไม่เอื้ออำนวยต่างๆ38 การศึกษานี้พบคู่ยีนที่ซ้ำกันทั้งหมด 48 คู่ ซึ่งทั้งหมดเป็นการจำลองแบบแบ่งส่วน แสดงให้เห็นว่าการจำลองแบบแบ่งส่วนเป็นกลไกหลักในการเพิ่มจำนวนยีนในวงศ์นี้ มีรายงานในเอกสารว่าการจำลองแบบแบ่งส่วนสามารถส่งเสริมการเพิ่มจำนวนสมาชิกในวงศ์ยีน GRF ในพืช Arabidopsis และสตรอว์เบอร์รีได้อย่างมีประสิทธิภาพ และไม่พบการจำลองแบบ Tandem ของวงศ์ยีนนี้ในพืชชนิดใดเลย27,39 ผลการศึกษานี้สอดคล้องกับการศึกษาที่มีอยู่เกี่ยวกับวงศ์ Arabidopsis thaliana และสตรอว์เบอร์รี ซึ่งชี้ให้เห็นว่าวงศ์ GRF สามารถเพิ่มจำนวนยีนและสร้างยีนใหม่ผ่านการจำลองแบบแบ่งส่วนในพืชชนิดต่างๆ
ในการศึกษานี้ พบยีน BjGRF ทั้งหมด 34 ยีนในมัสตาร์ด ซึ่งแบ่งออกเป็น 3 วงศ์ย่อย ยีนเหล่านี้มีโมทีฟและโครงสร้างยีนที่อนุรักษ์ไว้คล้ายคลึงกัน การวิเคราะห์ความสัมพันธ์เชิงโคลิเนียริตีพบการซ้ำซ้อนของส่วนต่างๆ ในมัสตาร์ด 48 คู่ บริเวณโปรโมเตอร์ของ BjGRF ประกอบด้วยองค์ประกอบซิส-แอคติงที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองต่อแสง การตอบสนองของฮอร์โมน การตอบสนองต่อความเครียดจากสภาพแวดล้อม และการเจริญเติบโตและพัฒนาการ ตรวจพบการแสดงออกของยีน BjGRF จำนวน 34 ยีนที่ระยะต้นกล้ามัสตาร์ด (ราก ลำต้น ใบ) และรูปแบบการแสดงออกของยีน BjGRF จำนวน 10 ยีนภายใต้สภาวะแห้งแล้ง พบว่ารูปแบบการแสดงออกของยีน BjGRF ภายใต้สภาวะแห้งแล้งมีความคล้ายคลึงกันและอาจคล้ายคลึงกัน การมีส่วนร่วมในการควบคุมการบังคับจากสภาวะแห้งแล้ง ยีน BjGRF03 และ BjGRF32 อาจมีบทบาทเชิงบวกในการควบคุมภาวะเครียดจากภัยแล้ง ขณะที่ยีน BjGRF06 และ BjGRF23 มีบทบาทในภาวะเครียดจากภัยแล้งในฐานะยีนเป้าหมายของ miR396 โดยรวมแล้ว การศึกษาของเราให้พื้นฐานทางชีวภาพสำหรับการค้นพบการทำงานของยีน BjGRF ในพืชตระกูล Brassicaceae ในอนาคต
เมล็ดมัสตาร์ดที่ใช้ในการทดลองนี้ได้รับจากสถาบันวิจัยเมล็ดพันธุ์น้ำมันกุ้ยโจว วิทยาลัยวิทยาศาสตร์การเกษตรกุ้ยโจว เลือกเมล็ดทั้งหมดแล้วปลูกลงในดิน (อัตราส่วนดิน: ดิน = 3:1) และเก็บราก ลำต้น และใบหลังจากระยะใบสี่ใบแล้ว ต้นมัสตาร์ดได้รับ PEG 6000 ความเข้มข้น 20% เพื่อจำลองสภาวะแห้งแล้ง และเก็บใบหลังจาก 0, 3, 6, 12 และ 24 ชั่วโมง ตัวอย่างพืชทั้งหมดถูกแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวทันที จากนั้นนำไปเก็บไว้ในช่องแช่แข็งที่อุณหภูมิ -80°C สำหรับการทดสอบครั้งต่อไป
ข้อมูลทั้งหมดที่ได้รับหรือวิเคราะห์ในระหว่างการศึกษานี้จะรวมอยู่ในบทความที่ตีพิมพ์และไฟล์ข้อมูลเสริม