การประเมินไอโอดีนและอะเวอร์เมกตินเป็นตัวเหนี่ยวนำโรคไส้เดือนฝอยในต้นสน

ไส้เดือนฝอยสนเป็นปรสิตภายในชนิดกักกันที่อพยพย้ายถิ่นฐาน ซึ่งทราบกันดีว่าก่อให้เกิดความสูญเสียทางเศรษฐกิจอย่างรุนแรงในระบบนิเวศป่าสน การศึกษานี้ทบทวนฤทธิ์ของอินโดลฮาโลเจนต่อไส้เดือนฝอยสนและกลไกการออกฤทธิ์ ฤทธิ์ของ 5-ไอโอโดอินโดลและอะเวอร์เมกติน (กลุ่มควบคุมเชิงบวก) ต่อไส้เดือนฝอยสนมีความคล้ายคลึงกันและมีฤทธิ์สูงที่ความเข้มข้นต่ำ (10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) 5-ไอโอโดอินโดลช่วยลดอัตราการเจริญพันธุ์ กิจกรรมการสืบพันธุ์ การตายของตัวอ่อนและตัวอ่อน และพฤติกรรมการเคลื่อนไหว ปฏิกิริยาทางโมเลกุลของลิแกนด์กับตัวรับช่องคลอไรด์แบบกลูตาเมตที่จำเพาะต่อสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลัง สนับสนุนแนวคิดที่ว่า 5-ไอโอโดอินโดล เช่นเดียวกับอะเวอร์เมกติน จับกับบริเวณที่ออกฤทธิ์ของตัวรับได้อย่างแน่นหนา 5-ไอโอโดอินโดลยังทำให้เกิดการผิดรูปของฟีโนไทป์ต่างๆ ในไส้เดือนฝอย รวมถึงการยุบตัว/หดตัวของอวัยวะที่ผิดปกติ และการเพิ่มขึ้นของแวคิวโอล ผลการศึกษาเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าแวคิวโอลอาจมีบทบาทในการตายที่เกิดจากกระบวนการเมทิลเลชันของไส้เดือนฝอย ที่สำคัญ 5-ไอโอโดอินโดลไม่เป็นพิษต่อพืชทั้งสองชนิด (กะหล่ำปลีและหัวไชเท้า) ดังนั้น การศึกษานี้จึงแสดงให้เห็นว่าการใช้ไอโอโดอินโดลภายใต้สภาวะแวดล้อมสามารถควบคุมความเสียหายจากโรคเหี่ยวจากต้นสนได้
ไส้เดือนฝอยไม้สน (Bursaphelenchus xylophilus) จัดอยู่ในกลุ่มไส้เดือนฝอยไม้สน (Pinewood Nematodes: PWN) ซึ่งเป็นไส้เดือนฝอยปรสิตภายในที่อพยพย้ายถิ่นฐาน เป็นที่ทราบกันดีว่าสร้างความเสียหายอย่างรุนแรงต่อระบบนิเวศป่าสน1 โรคเหี่ยวเฉาของสน (PWD) ที่เกิดจากไส้เดือนฝอยไม้สนกำลังกลายเป็นปัญหาร้ายแรงในหลายทวีป รวมถึงเอเชียและยุโรป และในอเมริกาเหนือ ไส้เดือนฝอยได้ทำลายพันธุ์สนที่นำเข้ามา1,2 การลดลงของต้นสนเป็นปัญหาทางเศรษฐกิจที่สำคัญ และแนวโน้มการแพร่กระจายไปทั่วโลกนั้นน่ากังวล3 พันธุ์สนต่อไปนี้มักถูกไส้เดือนฝอยโจมตีมากที่สุด ได้แก่ Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii และ Pinus radiata4 ไส้เดือนฝอยไม้สนเป็นโรคร้ายแรงที่สามารถฆ่าต้นสนได้ภายในไม่กี่สัปดาห์หรือไม่กี่เดือนหลังจากการติดเชื้อ นอกจากนี้ การระบาดของไส้เดือนฝอยในสนยังพบได้ทั่วไปในระบบนิเวศที่หลากหลาย ดังนั้นจึงทำให้เกิดห่วงโซ่การติดเชื้อที่ต่อเนื่องกัน1
Bursaphelenchus xylophilus เป็นไส้เดือนฝอยปรสิตพืชกักกันที่อยู่ในวงศ์ย่อย Aphelenchoidea และ clade 102.5 ไส้เดือนฝอยชนิดนี้กินเชื้อราและขยายพันธุ์ในเนื้อเยื่อไม้ของต้นสน โดยพัฒนาเป็นตัวอ่อน 4 ระยะ ได้แก่ L1, L2, L3, L4 และตัวเต็มวัย 1,6 ในสภาวะที่ขาดแคลนอาหาร ไส้เดือนฝอยสนจะเข้าสู่ระยะตัวอ่อนเฉพาะ คือ dauer ซึ่งเป็นปรสิตของแมลงปีกแข็งเปลือกสน (Monochamus alternatus) และถูกย้ายไปยังต้นสนที่แข็งแรง ในพืชอาศัยที่แข็งแรง ไส้เดือนฝอยจะอพยพผ่านเนื้อเยื่อพืชอย่างรวดเร็วและกินเซลล์พาเรนไคมา ซึ่งนำไปสู่ปฏิกิริยาภูมิแพ้หลายชนิด ต้นสนเหี่ยวเฉา และตายภายในหนึ่งปีหลังจากการติดเชื้อ 1,7,8
การควบคุมไส้เดือนฝอยสนทางชีวภาพเป็นความท้าทายมายาวนาน โดยมีมาตรการกักกันโรคย้อนกลับไปถึงศตวรรษที่ 20 กลยุทธ์ปัจจุบันในการควบคุมไส้เดือนฝอยสนส่วนใหญ่เกี่ยวข้องกับการใช้สารเคมี รวมถึงการรมควันไม้และการฝังตัวของไส้เดือนฝอยลงในลำต้นไม้ ไส้เดือนฝอยที่นิยมใช้มากที่สุดคืออะเวอร์เมกตินและอะเวอร์เมกตินเบนโซเอต ซึ่งอยู่ในตระกูลอะเวอร์เมกติน สารเคมีราคาแพงเหล่านี้มีประสิทธิภาพสูงในการกำจัดไส้เดือนฝอยหลายชนิดและถือว่าปลอดภัยต่อสิ่งแวดล้อม9 อย่างไรก็ตาม การใช้ไส้เดือนฝอยเหล่านี้ซ้ำๆ คาดว่าจะสร้างแรงกดดันในการคัดเลือก ซึ่งเกือบจะนำไปสู่การเกิดไส้เดือนฝอยสนที่ต้านทานได้อย่างแน่นอน ดังที่ได้แสดงให้เห็นในแมลงศัตรูพืชหลายชนิด เช่น เลปติโนทาร์ซาเดเซมลิเนตา พลูเทลลา ไซโลสเตลลา และไส้เดือนฝอยไตรโคสตรองทิลัส โคลูบริฟอร์มิส และออสเตอร์ตาเจีย เซอร์คัมซินตา ซึ่งค่อยๆ พัฒนาความต้านทานต่ออะเวอร์เมกติน10,11,12 ดังนั้น จึงจำเป็นต้องมีการศึกษารูปแบบความต้านทานและคัดกรองสารกำจัดไส้เดือนฝอยอย่างสม่ำเสมอ เพื่อค้นหาวิธีการควบคุม PVD ทางเลือกที่คุ้มค่าและเป็นมิตรต่อสิ่งแวดล้อม ในช่วงหลายทศวรรษที่ผ่านมา ผู้เขียนหลายท่านได้เสนอให้ใช้สารสกัดจากพืช น้ำมันหอมระเหย และสารระเหยเป็นสารควบคุมไส้เดือนฝอย13,14,15,16
เมื่อไม่นานมานี้ เราได้สาธิตฤทธิ์ของอินโดล ซึ่งเป็นโมเลกุลส่งสัญญาณระหว่างเซลล์และระหว่างอาณาจักร ใน Caenorhabditis elegans 17 อินโดลเป็นสัญญาณภายในเซลล์ที่แพร่หลายในนิเวศวิทยาจุลินทรีย์ โดยควบคุมการทำงานมากมายที่ส่งผลต่อสรีรวิทยาของจุลินทรีย์ การสร้างสปอร์ ความเสถียรของพลาสมิด การดื้อยา การสร้างไบโอฟิล์ม และความรุนแรงของเชื้อ 18, 19 ยังไม่มีการศึกษาฤทธิ์ของอินโดลและอนุพันธ์ต่อไส้เดือนฝอยก่อโรคชนิดอื่นๆ ในการศึกษานี้ เราได้ศึกษาฤทธิ์ของอินโดล 34 ชนิดต่อไส้เดือนฝอยสน และอธิบายกลไกการออกฤทธิ์ของ 5-ไอโอโดอินโดลที่มีฤทธิ์แรงที่สุด โดยใช้กล้องจุลทรรศน์ การถ่ายภาพแบบไทม์แลปส์ และการทดลองการเชื่อมต่อโมเลกุล และประเมินผลกระทบที่เป็นพิษต่อพืชโดยใช้การทดสอบการงอกของเมล็ด
มีรายงานก่อนหน้านี้ว่าอินโดลความเข้มข้นสูง (>1.0 มิลลิโมลาร์) มีผลต่อไส้เดือนฝอย 17 หลังจากการทดลองกับ B. xylophilus (ระยะชีวิตผสม) ด้วยอินโดลหรือสารอนุพันธ์อินโดล 33 ชนิดที่ความเข้มข้น 1 มิลลิโมลาร์ อัตราการตายของ B. xylophilus ถูกวัดโดยการนับจำนวนไส้เดือนฝอยที่มีชีวิตและตายในกลุ่มควบคุมและกลุ่มที่ทดลอง พบว่าอินโดล 5 ชนิดแสดงฤทธิ์ต่อไส้เดือนฝอยอย่างมีนัยสำคัญ อัตราการรอดชีวิตของกลุ่มควบคุมที่ไม่ทดลองอยู่ที่ 95 ± 7% หลังจาก 24 ชั่วโมง จากอินโดล 34 ชนิดที่ทดสอบ พบว่า 5-ไอโอโดอินโดลและ 4-ฟลูออโรอินโดลที่ความเข้มข้น 1 มิลลิโมลาร์ ทำให้อัตราการตาย 100% ในขณะที่ 5,6-ไดฟลูออโรอินดิโก เมทิลอินโดล-7-คาร์บอกซิเลต และ 7-ไอโอโดอินโดล ทำให้อัตราการตายประมาณ 50% (ตารางที่ 1)
ผลของ 5-ไอโอโดอินโดลต่อการสร้างแวคิวโอลและเมแทบอลิซึมของไส้เดือนฝอยไม้สน (A) ผลของอะเวอร์เมกตินและ 5-ไอโอโดอินโดลต่อไส้เดือนฝอยตัวผู้โตเต็มวัย (B) ไข่ไส้เดือนฝอยระยะ L1 และ (C) เมแทบอลิซึมของ B. xylophilus (i) ไม่พบแวคิวโอลที่ 0 ชั่วโมง การทดลองทำให้เกิด (ii) แวคิวโอล (iii) การสะสมของแวคิวโอลหลายอัน (iv) การบวมของแวคิวโอล (v) การหลอมรวมของแวคิวโอล และ (vi) การเกิดแวคิวโอลขนาดยักษ์ ลูกศรสีแดงแสดงถึงการบวมของแวคิวโอล ลูกศรสีน้ำเงินแสดงถึงการหลอมรวมของแวคิวโอล และลูกศรสีดำแสดงถึงแวคิวโอลขนาดยักษ์ แถบมาตราส่วน = 50 ไมโครเมตร
นอกจากนี้ การศึกษานี้ยังได้อธิบายกระบวนการต่อเนื่องของการตายที่เกิดจากมีเทนในไส้เดือนฝอยสน (รูปที่ 4C) การตายจากมีเทนเป็นการตายของเซลล์แบบไม่เกิดอะพอพโทซิส ซึ่งเกี่ยวข้องกับการสะสมของแวคิวโอลในไซโทพลาสซึมที่โดดเด่น27 ความผิดปกติทางสัณฐานวิทยาที่พบในไส้เดือนฝอยสนดูเหมือนจะมีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับกลไกการตายที่เกิดจากมีเทน การตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์ในช่วงเวลาต่างๆ พบว่าแวคิวโอลขนาดใหญ่เกิดขึ้นหลังจากสัมผัสกับ 5-ไอโอโดอินโดล (0.1 มิลลิโมลาร์) เป็นเวลา 20 ชั่วโมง แวคิวโอลขนาดเล็กพบหลังจากการรักษา 8 ชั่วโมง และจำนวนแวคิวโอลเพิ่มขึ้นหลังจากการรักษา 12 ชั่วโมง พบแวคิวโอลขนาดใหญ่หลายอันหลังจากการรักษา 14 ชั่วโมง แวคิวโอลที่หลอมรวมกันหลายอันมองเห็นได้ชัดเจนหลังจากการรักษา 12-16 ชั่วโมง ซึ่งบ่งชี้ว่าการหลอมรวมของแวคิวโอลเป็นพื้นฐานของกลไกการตายจากมีเทน หลังจากการรักษา 20 ชั่วโมง พบแวคิวโอลขนาดใหญ่หลายอันทั่วทั้งตัวหนอน การสังเกตเหล่านี้ถือเป็นรายงานครั้งแรกของการเกิด metuosis ใน C. elegans
ในหนอนที่ได้รับการรักษาด้วย 5-ไอโอโดอินโดล ยังพบการรวมตัวและการแตกของแวคิวโอล (รูปที่ 5) ซึ่งเห็นได้จากการโค้งงอของหนอนและการปล่อยแวคิวโอลออกสู่สิ่งแวดล้อม นอกจากนี้ยังพบการแตกของแวคิวโอลในเยื่อเปลือกไข่ ซึ่งปกติจะคงสภาพสมบูรณ์ด้วย L2 ในระหว่างการฟักไข่ (รูปเสริม S2) การสังเกตเหล่านี้สนับสนุนการมีส่วนร่วมของการสะสมของเหลวและความล้มเหลวในการควบคุมความเข้มข้นของออสโมรี รวมถึงการบาดเจ็บของเซลล์แบบกลับคืนได้ (RCI) ในกระบวนการสร้างแวคิวโอลและการเกิดหนอง (รูปที่ 5)
โดยตั้งสมมติฐานเกี่ยวกับบทบาทของไอโอดีนในการสร้างแวคิวโอลที่สังเกตได้ เราได้ศึกษาฤทธิ์ของโซเดียมไอโอไดด์ (NaI) และโพแทสเซียมไอโอไดด์ (KI) อย่างไรก็ตาม ที่ความเข้มข้น (0.1, 0.5 หรือ 1 มิลลิโมลาร์) ฤทธิ์เหล่านี้ไม่มีผลต่อการอยู่รอดของไส้เดือนฝอยหรือการสร้างแวคิวโอล (ภาพเสริม S5) แม้ว่า KI ที่ความเข้มข้น 1 มิลลิโมลาร์จะมีฤทธิ์ของเนมาติไดด์เล็กน้อย ในทางกลับกัน 7-ไอโอโดอินโดล (1 หรือ 2 มิลลิโมลาร์) เช่นเดียวกับ 5-ไอโอโดอินโดล ทำให้เกิดแวคิวโอลหลายอันและโครงสร้างผิดรูป (ภาพเสริม S6) ไอโอโดอินโดลทั้งสองแสดงลักษณะทางฟีโนไทป์ที่คล้ายคลึงกันในไส้เดือนฝอยสน ในขณะที่ NaI และ KI ไม่แสดง ที่น่าสนใจคือ อินโดลไม่ได้เหนี่ยวนำให้เกิดแวคิวโอลใน B. xylophilus ที่ความเข้มข้นที่ทดสอบ (ข้อมูลไม่ได้แสดง) ดังนั้นผลการศึกษาจึงยืนยันว่าสารประกอบอินโดล-ไอโอดีนมีหน้าที่ในการสร้างช่องว่างและการเผาผลาญของ B. xylophilus
ในบรรดาอินโดลที่ทดสอบฤทธิ์เนมาติไดด์ 5-ไอโอโดอินโดลมีดัชนีการลื่นสูงสุดที่ -5.89 กิโลแคลอรี/โมล รองลงมาคือ 7-ไอโอโดอินโดล (-4.48 กิโลแคลอรี/โมล) 4-ฟลูออโรอินโดล (-4.33) และอินโดล (-4.03) (รูปที่ 6) พันธะไฮโดรเจนที่แข็งแกร่งของ 5-ไอโอโดอินโดลกับลิวซีน 218 ช่วยให้การจับยึดของลิวซีนมีเสถียรภาพ ในขณะที่อนุพันธ์อินโดลอื่นๆ ทั้งหมดจะจับกับเซอรีน 260 ผ่านพันธะไฮโดรเจนของสายข้างเคียง ในบรรดาไอโอโดอินโดลจำลองอื่นๆ 2-ไอโอโดอินโดลมีค่าการจับอยู่ที่ -5.248 กิโลแคลอรีต่อโมล ซึ่งเกิดจากพันธะไฮโดรเจนหลักกับลิวซีน 218 การจับที่ทราบอื่นๆ ได้แก่ 3-ไอโอโดอินโดล (-4.3 กิโลแคลอรีต่อโมล), 4-ไอโอโดอินโดล (-4.0 กิโลแคลอรีต่อโมล) และ 6-ฟลูออโรอินโดล (-2.6 กิโลแคลอรีต่อโมล) (ภาพเสริม S8) อินโดลและอินโดลที่ถูกเติมฮาโลเจนส่วนใหญ่ ยกเว้น 5-ไอโอโดอินโดล และ 2-ไอโอโดอินโดล จะสร้างพันธะกับเซอรีน 260 ความจริงที่ว่าพันธะไฮโดรเจนกับลิวซีน 218 บ่งชี้ถึงการจับกันระหว่างรีเซพเตอร์และลิแกนด์ที่มีประสิทธิภาพ ดังเช่นที่พบในไอเวอร์เมกติน (ภาพเสริม S7) ยืนยันว่า 5-ไอโอโดอินโดลและ 2-ไอโอโดอินโดล เช่นเดียวกับไอเวอร์เมกติน จับกันแน่นกับบริเวณแอคทีฟของรีเซพเตอร์ GluCL ผ่านลิวซีน 218 (ภาพที่ 6 และภาพเสริม S8) เราเสนอว่าการจับกันนี้จำเป็นต่อการรักษาโครงสร้างรูพรุนเปิดของคอมเพล็กซ์ GluCL และด้วยการจับกันแน่นกับบริเวณแอคทีฟของรีเซพเตอร์ GluCL 5-ไอโอโดอินโดล 2-ไอโอโดอินโดล อะเวอร์เมกติน และไอเวอร์เมกติน จึงรักษาช่องไอออนให้เปิดอยู่และยอมให้ของเหลวถูกดูดเข้าไปได้
การเชื่อมต่อโมเลกุลของอินโดลและอินโดลฮาโลเจนกับ GluCL ทิศทางการจับของลิแกนด์ (A) อินโดล (B) 4-ฟลูออโรอินโดล (C) 7-ไอโอโดอินโดล และ (D) 5-ไอโอโดอินโดล กับตำแหน่งแอคทีฟของ GluCL โปรตีนแสดงด้วยริบบิ้น และพันธะไฮโดรเจนแกนหลักแสดงด้วยเส้นประสีเหลือง (A′), (B′), (C′) และ (D′) แสดงอันตรกิริยาระหว่างลิแกนด์ที่สอดคล้องกับกรดอะมิโนที่ตกค้างอยู่โดยรอบ และพันธะไฮโดรเจนของสายข้างเคียงแสดงด้วยลูกศรประสีชมพู
ได้ทำการทดลองเพื่อประเมินผลความเป็นพิษของ 5-ไอโอโดอินโดลต่อการงอกของเมล็ดกะหล่ำปลีและหัวไชเท้า พบว่า 5-ไอโอโดอินโดล (0.05 หรือ 0.1 มิลลิโมลาร์) หรืออะเวอร์เมกติน (10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) มีผลเพียงเล็กน้อยหรือแทบไม่มีผลเลยต่อการงอกเริ่มต้นและการงอกของต้นอ่อน (รูปที่ 7) นอกจากนี้ ยังไม่พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างอัตราการงอกของเมล็ดควบคุมที่ไม่ได้รับการบำบัดกับเมล็ดที่ได้รับ 5-ไอโอโดอินโดลหรืออะเวอร์เมกติน ผลกระทบต่อการยืดตัวของรากแก้วและจำนวนรากข้างที่เกิดขึ้นไม่มีนัยสำคัญ แม้ว่า 5-ไอโอโดอินโดลที่ความเข้มข้น 1 มิลลิโมลาร์ (10 เท่าของความเข้มข้นที่ออกฤทธิ์) จะทำให้การพัฒนาของรากข้างล่าช้าลงเล็กน้อย ผลการทดลองเหล่านี้บ่งชี้ว่า 5-ไอโอโดอินโดลไม่เป็นพิษต่อเซลล์พืชและไม่รบกวนกระบวนการเจริญเติบโตของพืชที่ความเข้มข้นที่ศึกษา
ผลของ 5-ไอโอโดอินโดลต่อการงอกของเมล็ด การงอก การแตกหน่อ และการแตกรากด้านข้างของเมล็ด B. oleracea และ R. raphanistrum บนอาหารเลี้ยงเชื้อ Murashige และ Skoog agar ที่มีหรือไม่มี avermectin หรือ 5-ไอโอโดอินโดล บันทึกการงอกหลังจากบ่มเพาะที่อุณหภูมิ 22°C เป็นเวลา 3 วัน
การศึกษานี้รายงานหลายกรณีการฆ่าไส้เดือนฝอยด้วยอินโดล ที่สำคัญ นี่เป็นรายงานแรกของการที่ไอโอโดอินโดลเหนี่ยวนำให้เกิดเมทิลเลชัน (กระบวนการที่เกิดจากการสะสมของแวคิวโอลขนาดเล็กที่ค่อยๆ รวมตัวกันเป็นแวคิวโอลขนาดใหญ่ ซึ่งในที่สุดนำไปสู่การแตกของเยื่อหุ้มเซลล์และการตายของเซลล์) ในใบสน โดยไอโอโดอินโดลแสดงคุณสมบัติการออกฤทธิ์ของเนมาทิดัลอย่างมีนัยสำคัญ คล้ายกับคุณสมบัติของเนมาทิดไซด์อะเวอร์เมกติน ซึ่งเป็นเนมาทิดไซด์เชิงพาณิชย์
ก่อนหน้านี้มีรายงานว่าอินโดลมีบทบาทในการส่งสัญญาณหลายอย่างในโพรคาริโอตและยูคาริโอต รวมถึงการยับยั้ง/สร้างไบโอฟิล์ม การอยู่รอดของแบคทีเรีย และการก่อโรค19,32,33,34 เมื่อไม่นานมานี้ ผลการรักษาที่อาจเกิดขึ้นของอินโดลฮาโลเจน อินโดลอัลคาลอยด์ และอนุพันธ์อินโดลกึ่งสังเคราะห์ ได้ดึงดูดความสนใจจากการวิจัยอย่างกว้างขวาง35,36,37 ยกตัวอย่างเช่น อินโดลฮาโลเจนได้รับการพิสูจน์แล้วว่าสามารถฆ่าเซลล์ Escherichia coli และ Staphylococcus aureus ที่ดื้อยาได้37 นอกจากนี้ การศึกษาประสิทธิภาพของอินโดลฮาโลเจนต่อสปีชีส์ สกุล และอาณาจักรอื่นๆ ยังเป็นที่สนใจทางวิทยาศาสตร์ และการศึกษานี้ถือเป็นก้าวสำคัญในการบรรลุเป้าหมายนี้
ในที่นี้ เราเสนอกลไกการก่อให้เกิดความตายที่เกิดจาก 5-ไอโอโดอินโดลใน C. elegans โดยอาศัยการบาดเจ็บของเซลล์แบบกลับคืนได้ (RCI) และการเมทิลเลชัน (รูปที่ 4C และ 5) การเปลี่ยนแปลงที่ทำให้เกิดอาการบวมน้ำ เช่น อาการบวมน้ำและการเสื่อมของแวคิวโอล เป็นตัวบ่งชี้ของ RCI และการเมทิลเลชัน ซึ่งปรากฏเป็นแวคิวโอลขนาดใหญ่ในไซโทพลาสซึม48,49 RCI ขัดขวางการผลิตพลังงานโดยการลดการผลิต ATP ทำให้ปั๊ม ATPase ล้มเหลว หรือรบกวนเยื่อหุ้มเซลล์และทำให้เกิดการไหลเข้าของ Na+, Ca2+ และน้ำอย่างรวดเร็ว50,51,52 แวคิวโอลภายในไซโทพลาสซึมเกิดขึ้นในเซลล์สัตว์อันเป็นผลมาจากการสะสมของของเหลวในไซโทพลาสซึมอันเนื่องมาจากการไหลเข้าของ Ca2+ และน้ำ53 ที่น่าสนใจคือ กลไกการทำลายเซลล์นี้สามารถกลับคืนได้หากความเสียหายเป็นเพียงชั่วคราวและเซลล์เริ่มผลิต ATP เป็นระยะเวลาหนึ่ง แต่หากความเสียหายยังคงอยู่หรือแย่ลง เซลล์ก็จะตาย54 จากการสังเกตของเราแสดงให้เห็นว่าไส้เดือนฝอยที่ได้รับการบำบัดด้วย 5-ไอโอโดอินโดลไม่สามารถฟื้นฟูการสังเคราะห์ทางชีวภาพตามปกติได้หลังจากสัมผัสกับสภาวะเครียด
ฟีโนไทป์เมทิลเลชันที่เหนี่ยวนำโดย 5-ไอโอโดอินโดลใน B. xylophilus อาจเกิดจากการมีไอโอดีนและการกระจายตัวของโมเลกุล เนื่องจาก 7-ไอโอโดอินโดลมีฤทธิ์ยับยั้ง B. xylophilus น้อยกว่า 5-ไอโอโดอินโดล (ตารางที่ 1 และภาพเสริม S6) ผลลัพธ์เหล่านี้สอดคล้องบางส่วนกับการศึกษาของ Maltese และคณะ (2014) ซึ่งรายงานว่าการเคลื่อนย้ายหมู่ไพริดิลไนโตรเจนในอินโดลจากพารา- ... ปฏิกิริยาระหว่างอินโดลหรืออินโดลฮาโลเจนกับตัวรับ GluCL ที่สังเกตได้ในการศึกษานี้ก็สนับสนุนแนวคิดนี้เช่นกัน เนื่องจากพบว่า 5- และ 2-ไอโอโดอินโดลจับกับตัวรับ GluCL ได้แรงกว่าอินโดลอื่นๆ ที่ตรวจสอบ (รูปที่ 6 และรูปเสริม S8) พบว่าไอโอดีนที่ตำแหน่งที่สองหรือห้าของอินโดลจับกับลิวซีน 218 ของตัวรับ GluCL ผ่านพันธะไฮโดรเจนแกนหลัก ในขณะที่อินโดลฮาโลเจนอื่นๆ และตัวอินโดลเองสร้างพันธะไฮโดรเจนสายข้างที่อ่อนกับเซอรีน 260 (รูปที่ 6) ดังนั้นเราจึงสันนิษฐานว่าตำแหน่งของฮาโลเจนมีบทบาทสำคัญในการเหนี่ยวนำให้เกิดการเสื่อมของแวคิวโอล ในขณะที่การจับกันอย่างแน่นหนาของ 5-ไอโอโดอินโดลทำให้ช่องไอออนเปิดอยู่ ทำให้เกิดการไหลเข้าของของเหลวอย่างรวดเร็วและแวคิวโอลแตก อย่างไรก็ตาม กลไกการออกฤทธิ์โดยละเอียดของ 5-ไอโอโดอินโดลยังคงต้องศึกษาต่อไป
ก่อนการนำ 5-ไอโอโดอินโดลไปใช้งานจริง ควรวิเคราะห์ผลกระทบที่เป็นพิษต่อพืช การทดลองการงอกของเมล็ดของเราแสดงให้เห็นว่า 5-ไอโอโดอินโดลไม่มีผลเสียต่อการงอกของเมล็ดหรือกระบวนการเจริญเติบโตในภายหลังที่ความเข้มข้นที่ศึกษา (รูปที่ 7) ดังนั้น การศึกษานี้จึงเป็นพื้นฐานสำหรับการใช้ 5-ไอโอโดอินโดลในสภาพแวดล้อมทางนิเวศวิทยาเพื่อควบคุมอันตรายของไส้เดือนฝอยในต้นสน
รายงานก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าการบำบัดด้วยอินโดลเป็นแนวทางที่มีศักยภาพในการแก้ไขปัญหาการดื้อยาปฏิชีวนะและการลุกลามของมะเร็ง55 นอกจากนี้ อินโดลยังมีฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรีย ต้านมะเร็ง ต้านอนุมูลอิสระ ต้านการอักเสบ ต้านเบาหวาน ต้านไวรัส ต้านการแพร่กระจายของเซลล์ และต้านวัณโรค และอาจเป็นพื้นฐานสำคัญในการพัฒนายา56,57 การศึกษานี้ชี้ให้เห็นถึงศักยภาพในการใช้ไอโอดีนเป็นยาต้านปรสิตและยาถ่ายพยาธิเป็นครั้งแรก
อะเวอร์เมกตินถูกค้นพบเมื่อสามทศวรรษก่อนและได้รับรางวัลโนเบลในปี พ.ศ. 2558 และยังคงใช้รักษาโรคพยาธิอย่างต่อเนื่อง อย่างไรก็ตาม เนื่องจากความต้านทานต่ออะเวอร์เมกตินในไส้เดือนฝอยและแมลงศัตรูพืชมีการพัฒนาอย่างรวดเร็ว จึงจำเป็นต้องมีกลยุทธ์ทางเลือกที่ประหยัดต้นทุนและเป็นมิตรต่อสิ่งแวดล้อมเพื่อควบคุมการติดเชื้อ PWN ในต้นสน การศึกษานี้ยังรายงานกลไกที่ 5-ไอโอโดอินโดลฆ่าไส้เดือนฝอยในต้นสน และพบว่า 5-ไอโอโดอินโดลมีความเป็นพิษต่ำต่อเซลล์พืช ซึ่งเปิดโอกาสที่ดีสำหรับการนำไปใช้ในเชิงพาณิชย์ในอนาคต
การทดลองทั้งหมดได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมของมหาวิทยาลัย Yeungnam จังหวัด Gyeongsan ประเทศเกาหลีใต้ และดำเนินการตามแนวทางของคณะกรรมการจริยธรรมของมหาวิทยาลัย Yeungnam
การทดลองฟักไข่ได้ดำเนินการตามขั้นตอนที่กำหนดไว้43 เพื่อประเมินอัตราการฟัก (HR) ไส้เดือนฝอยตัวเต็มวัยอายุ 1 วัน (ตัวเมียประมาณ 100 ตัว และตัวผู้ 100 ตัว) ถูกย้ายไปยังจานเพาะเชื้อที่มีเชื้อรา และปล่อยให้เจริญเติบโตเป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นแยกไข่และบำบัดด้วย 5-ไอโอโดอินโดล (0.05 มิลลิโมลาร์ และ 0.1 มิลลิโมลาร์) หรืออะเวอร์เมกติน (10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นสารแขวนลอยในน้ำกลั่นที่ผ่านการฆ่าเชื้อ สารแขวนลอยเหล่านี้ (500 ไมโครลิตร ประมาณ 100 ฟอง) ถูกย้ายไปยังหลุมของจานเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ 24 หลุม และบ่มที่อุณหภูมิ 22 องศาเซลเซียส นับจำนวนไข่ที่ระดับ L2 หลังจากบ่มเพาะ 24 ชั่วโมง แต่จะถือว่าเซลล์ตายหากเซลล์ไม่เคลื่อนที่เมื่อถูกกระตุ้นด้วยลวดแพลทินัมขนาดเล็ก การทดลองนี้ดำเนินการเป็นสองขั้นตอน แต่ละขั้นตอนทำซ้ำหกครั้ง ข้อมูลจากทั้งสองการทดลองถูกนำมารวมกันและนำเสนอ เปอร์เซ็นต์ของ HR คำนวณได้ดังนี้:
ประเมินอัตราการตายของตัวอ่อนโดยใช้วิธีการที่พัฒนาขึ้นก่อนหน้านี้ โดยเก็บไข่ไส้เดือนฝอยและนำตัวอ่อนมาผสมกันโดยการฟักในน้ำกลั่นที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว เพื่อสร้างตัวอ่อนระยะ L2 ตัวอ่อนที่ผสมกัน (ประมาณ 500 ตัว) ได้รับ 5-ไอโอโดอินโดล (0.05 มิลลิโมลาร์ และ 0.1 มิลลิโมลาร์) หรืออะเวอร์เมกติน (10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) และเลี้ยงบนจานเพาะเชื้อ B. cinerea Petri หลังจากบ่มที่อุณหภูมิ 22 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 48 ชั่วโมง เก็บไส้เดือนฝอยในน้ำกลั่นที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว และตรวจสอบหาระยะ L2, L3 และ L4 พบว่าระยะ L3 และ L4 บ่งชี้ถึงการเปลี่ยนแปลงของตัวอ่อน ในขณะที่ระยะ L2 บ่งชี้ว่าไม่มีการเปลี่ยนแปลงใดๆ ภาพที่ได้จากระบบถ่ายภาพเซลล์ดิจิทัล iRiS™ การทดลองนี้ดำเนินการเป็นสองขั้นตอน แต่ละขั้นตอนทำซ้ำหกครั้ง ข้อมูลจากทั้งสองการทดลองได้รับการรวมและนำเสนอ
ประเมินความเป็นพิษของ 5-ไอโอโดอินโดลและอะเวอร์เมกตินต่อเมล็ดโดยใช้การทดสอบการงอกบนจานเพาะเชื้อ Murashige และ Skoog 62 เมล็ด B. oleracea และ R. raphanistrum ถูกแช่ในน้ำกลั่นที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วเป็นเวลาหนึ่งวัน ล้างด้วยเอทานอล 100% ปริมาตร 1 มิลลิลิตร ฆ่าเชื้อด้วยน้ำยาฟอกขาว 50% เชิงพาณิชย์ (โซเดียมไฮโปคลอไรต์ 3%) ปริมาตร 1 มิลลิลิตร เป็นเวลา 15 นาที และล้างด้วยน้ำที่ผ่านการฆ่าเชื้อ 1 มิลลิลิตร ห้าครั้ง จากนั้นนำเมล็ดที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วไปกดลงบนจานเพาะเชื้อที่มีอาหารเพาะเชื้อ Murashige และ Skoog ความเข้มข้น 0.86 กรัม/ลิตร (0.2 เท่า) และวุ้นแบคทีเรีย 0.7% ที่มีหรือไม่มี 5-ไอโอโดอินโดลหรืออะเวอร์เมกติน จากนั้นนำจานเพาะเชื้อไปบ่มที่อุณหภูมิ 22 องศาเซลเซียส และถ่ายภาพหลังจากบ่มเป็นเวลา 3 วัน การทดลองนี้ดำเนินการเป็นสองขั้นตอน แต่ละขั้นตอนทำซ้ำหกครั้ง