การประเมินไอโอดีนและอะเวอร์เมกตินในฐานะสารกระตุ้นโรคไส้เดือนฝอยในต้นสน

ไส้เดือนฝอยสนเป็นปรสิตภายในที่อพยพย้ายถิ่นซึ่งต้องควบคุม และเป็นที่รู้จักกันดีว่าก่อให้เกิดความเสียหายทางเศรษฐกิจอย่างรุนแรงในระบบนิเวศป่าสน งานวิจัยนี้ทบทวนฤทธิ์ในการกำจัดไส้เดือนฝอยสนของสารประกอบอินโดลที่มีฮาโลเจน และกลไกการออกฤทธิ์ของสารเหล่านี้ ฤทธิ์ในการกำจัดไส้เดือนฝอยสนของ 5-ไอโอโดอินโดลและอะเวอร์เมกติน (สารควบคุมเชิงบวก) มีความคล้ายคลึงกันและมีประสิทธิภาพสูงที่ความเข้มข้นต่ำ (10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) 5-ไอโอโดอินโดลช่วยลดความสามารถในการสืบพันธุ์ กิจกรรมการสืบพันธุ์ อัตราการตายของตัวอ่อนและลูกหนอน และพฤติกรรมการเคลื่อนที่ ปฏิสัมพันธ์ระดับโมเลกุลของลิแกนด์กับตัวรับช่องคลอไรด์ที่ควบคุมด้วยกลูตาเมตเฉพาะในสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลัง สนับสนุนแนวคิดที่ว่า 5-ไอโอโดอินโดล เช่นเดียวกับอะเวอร์เมกติน จับกับบริเวณออกฤทธิ์ของตัวรับอย่างแน่นหนา 5-ไอโอโดอินโดลยังทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงลักษณะภายนอกต่างๆ ในไส้เดือนฝอย รวมถึงการยุบตัว/หดตัวของอวัยวะที่ผิดปกติ และการเพิ่มขึ้นของช่องว่างภายในเซลล์ ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าช่องว่างภายในเซลล์อาจมีบทบาทในการตายของไส้เดือนฝอยที่เกิดจากการเติมหมู่เมทิล นอกจากนี้ 5-ไอโอโดอินโดลยังไม่เป็นพิษต่อพืชทั้งสองชนิด (กะหล่ำปลีและหัวไชเท้า) ดังนั้น การศึกษานี้แสดงให้เห็นว่าการใช้ไอโอโดอินโดลภายใต้สภาวะแวดล้อมที่เหมาะสมสามารถควบคุมความเสียหายจากโรคเหี่ยวของต้นสนได้
ไส้เดือนฝอยไม้สน (Bursaphelenchus xylophilus) จัดอยู่ในกลุ่มไส้เดือนฝอยไม้สน (PWN) ซึ่งเป็นไส้เดือนฝอยปรสิตภายในที่เคลื่อนย้ายได้ และเป็นที่รู้จักกันดีว่าก่อให้เกิดความเสียหายทางนิเวศวิทยาอย่างรุนแรงต่อระบบนิเวศป่าสน¹ โรคเหี่ยวของต้นสน (PWD) ที่เกิดจากไส้เดือนฝอยไม้สนกำลังกลายเป็นปัญหาที่ร้ายแรงในหลายทวีป รวมถึงเอเชียและยุโรป และในอเมริกาเหนือ ไส้เดือนฝอยนี้ทำลายต้นสนสายพันธุ์ที่นำเข้ามา^1,2 การเสื่อมโทรมของต้นสนเป็นปัญหาทางเศรษฐกิจที่สำคัญ และแนวโน้มการแพร่กระจายไปทั่วโลกนั้นน่าเป็นห่วง³ สายพันธุ์สนต่อไปนี้มักถูกไส้เดือนฝอยโจมตีมากที่สุด: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii และ Pinus radiata⁴ ไส้เดือนฝอยไม้สนเป็นโรคที่ร้ายแรงที่สามารถฆ่าต้นสนได้ภายในไม่กี่สัปดาห์หรือหลายเดือนหลังจากการติดเชื้อ นอกจากนี้ การระบาดของไส้เดือนฝอยสนยังพบได้ทั่วไปในระบบนิเวศหลากหลายประเภท ดังนั้นจึงมีการสร้างห่วงโซ่การติดเชื้อที่ต่อเนื่องขึ้นมา¹
Bursaphelenchus xylophilus เป็นไส้เดือนฝอยปรสิตพืชที่ต้องควบคุม ซึ่งอยู่ในวงศ์ใหญ่ Aphelenchoidea และกลุ่ม 102.5 ไส้เดือนฝอยชนิดนี้กินเชื้อราและขยายพันธุ์ในเนื้อไม้ของต้นสน โดยพัฒนาเป็นตัวอ่อน 4 ระยะ ได้แก่ L1, L2, L3, L4 และตัวเต็มวัย1,6 ในสภาวะขาดแคลนอาหาร ไส้เดือนฝอยสนจะเข้าสู่ระยะตัวอ่อนพิเศษ คือ ระยะดอร์ (dauer) ซึ่งจะไปเป็นปรสิตในพาหะ คือ ด้วงเปลือกสน (Monochamus alternatus) และถูกถ่ายทอดไปยังต้นสนที่แข็งแรง ในต้นสนที่แข็งแรง ไส้เดือนฝอยจะเคลื่อนที่ผ่านเนื้อเยื่อพืชอย่างรวดเร็วและกินเซลล์พาเรนไคมา ซึ่งนำไปสู่ปฏิกิริยาภูมิแพ้หลายอย่าง ทำให้ต้นสนเหี่ยวเฉาและตายภายในหนึ่งปีหลังการติดเชื้อ1,7,8
การควบคุมไส้เดือนฝอยสนด้วยวิธีทางชีวภาพเป็นความท้าทายมานานแล้ว โดยมาตรการกักกันมีมาตั้งแต่ศตวรรษที่ 20 กลยุทธ์ในปัจจุบันสำหรับการควบคุมไส้เดือนฝอยสนส่วนใหญ่เกี่ยวข้องกับการบำบัดทางเคมี รวมถึงการรมไม้และการฝังสารฆ่าไส้เดือนฝอยลงในลำต้น สารฆ่าไส้เดือนฝอยที่ใช้กันทั่วไปมากที่สุดคืออะเวอร์เมกตินและอะเวอร์เมกตินเบนโซเอต ซึ่งอยู่ในตระกูลอะเวอร์เมกติน สารเคมีราคาแพงเหล่านี้มีประสิทธิภาพสูงต่อไส้เดือนฝอยหลายชนิดและถือว่าปลอดภัยต่อสิ่งแวดล้อม9 อย่างไรก็ตาม การใช้สารฆ่าไส้เดือนฝอยเหล่านี้ซ้ำๆ คาดว่าจะสร้างแรงกดดันในการคัดเลือกซึ่งเกือบจะแน่นอนว่าจะนำไปสู่การเกิดขึ้นของไส้เดือนฝอยสนที่ดื้อยา ดังที่ได้แสดงให้เห็นแล้วสำหรับแมลงศัตรูพืชหลายชนิด เช่น Leptinotarsa ​​​​decemlineata, Plutella xylostella และไส้เดือนฝอย Trichostrongylus colubriformis และ Ostertagia circumcincta ซึ่งค่อยๆ พัฒนาความต้านทานต่ออะเวอร์เมกติน10,11,12 ดังนั้น จึงจำเป็นต้องศึกษาแบบแผนความต้านทานอย่างสม่ำเสมอและคัดกรองสารกำจัดไส้เดือนฝอยอย่างต่อเนื่องเพื่อหาวิธีการทางเลือกที่มีประสิทธิภาพ คุ้มค่า และเป็นมิตรต่อสิ่งแวดล้อมในการควบคุม PVD ในช่วงไม่กี่ทศวรรษที่ผ่านมา ผู้เขียนหลายท่านได้เสนอให้ใช้สารสกัดจากพืช น้ำมันหอมระเหย และสารระเหยเป็นสารควบคุมไส้เดือนฝอย13,14,15,16
เมื่อเร็วๆ นี้ เราได้แสดงให้เห็นถึงฤทธิ์ฆ่าไส้เดือนฝอยของอินโดล ซึ่งเป็นโมเลกุลส่งสัญญาณระหว่างเซลล์และระหว่างอาณาจักร ใน Caenorhabditis elegans 17 อินโดลเป็นสัญญาณภายในเซลล์ที่แพร่หลายในระบบนิเวศของจุลินทรีย์ ควบคุมการทำงานต่างๆ มากมายที่ส่งผลต่อสรีรวิทยาของจุลินทรีย์ การสร้างสปอร์ ความเสถียรของพลาสมิด ความต้านทานยา การสร้างไบโอฟิล์ม และความรุนแรง 18, 19 ยังไม่มีการศึกษาถึงฤทธิ์ของอินโดลและอนุพันธ์ของมันต่อไส้เดือนฝอยก่อโรคชนิดอื่นๆ ในการศึกษานี้ เราได้ตรวจสอบฤทธิ์ฆ่าไส้เดือนฝอยของอินโดล 34 ชนิดต่อไส้เดือนฝอยสน และอธิบายกลไกการออกฤทธิ์ของ 5-ไอโอโดอินโดลที่มีฤทธิ์แรงที่สุดโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ การถ่ายภาพแบบไทม์แลปส์ และการทดลองด็อกกิ้งระดับโมเลกุล และประเมินผลกระทบที่เป็นพิษต่อพืชโดยใช้การทดสอบการงอกของเมล็ด
ก่อนหน้านี้มีรายงานว่าอินโดลที่มีความเข้มข้นสูง (>1.0 mM) มีฤทธิ์ฆ่าไส้เดือนฝอย¹⁷ หลังจากทำการรักษา B. xylophilus (ในระยะต่างๆ ของวงจรชีวิต) ด้วยอินโดลหรืออนุพันธ์ของอินโดล 33 ชนิดที่ความเข้มข้น 1 mM แล้ว ได้ทำการวัดอัตราการตายของ B. xylophilus โดยการนับจำนวนไส้เดือนฝอยที่ยังมีชีวิตและตายในกลุ่มควบคุมและกลุ่มที่ได้รับการรักษา อินโดล 5 ชนิดแสดงฤทธิ์ฆ่าไส้เดือนฝอยอย่างมีนัยสำคัญ โดยกลุ่มควบคุมที่ไม่ได้รับการรักษามีอัตราการรอดชีวิต 95 ± 7% หลังจาก 24 ชั่วโมง ในบรรดาอินโดล 34 ชนิดที่ทดสอบ 5-ไอโอโดอินโดลและ 4-ฟลูออโรอินโดลที่ความเข้มข้น 1 mM ทำให้เกิดการตาย 100% ในขณะที่ 5,6-ไดฟลูออโรอินดิโก เมทิลอินโดล-7-คาร์บอกซิเลต และ 7-ไอโอโดอินโดลทำให้เกิดการตายประมาณ 50% (ตารางที่ 1)
ผลของ 5-ไอโอโดอินโดลต่อการสร้างแวคิวโอลและการเผาผลาญของไส้เดือนฝอยไม้สน (A) ผลของอะเวอร์เมกตินและ 5-ไอโอโดอินโดลต่อไส้เดือนฝอยตัวผู้โตเต็มวัย (B) ไข่ไส้เดือนฝอยระยะ L1 และ (C) การเผาผลาญของ B. xylophilus (i) ไม่พบแวคิวโอลที่เวลา 0 ชั่วโมง การรักษาทำให้เกิด (ii) แวคิวโอล (iii) การสะสมของแวคิวโอลหลายอัน (iv) การบวมของแวคิวโอล (v) การรวมตัวของแวคิวโอล และ (vi) การก่อตัวของแวคิวโอลขนาดใหญ่ ลูกศรสีแดงแสดงถึงการบวมของแวคิวโอล ลูกศรสีน้ำเงินแสดงถึงการรวมตัวของแวคิวโอล และลูกศรสีดำแสดงถึงแวคิวโอลขนาดใหญ่ แถบมาตราส่วน = 50 μm
นอกจากนี้ การศึกษานี้ยังได้อธิบายกระบวนการลำดับขั้นของการตายที่เกิดจากมีเทนในไส้เดือนฝอยสน (รูปที่ 4C) การตายแบบมีเทนเป็นรูปแบบการตายของเซลล์ที่ไม่ใช่แบบอะพอพโทซิส ซึ่งเกี่ยวข้องกับการสะสมของช่องว่างไซโตพลาสมิกที่เด่นชัด27 ความผิดปกติทางสัณฐานวิทยาที่สังเกตได้ในไส้เดือนฝอยสนดูเหมือนจะเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับกลไกการตายที่เกิดจากมีเทน การตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์ในช่วงเวลาต่างๆ แสดงให้เห็นว่าช่องว่างขนาดใหญ่ก่อตัวขึ้นหลังจากสัมผัสกับ 5-ไอโอโดอินโดล (0.1 mM) เป็นเวลา 20 ชั่วโมง พบช่องว่างขนาดเล็กหลังจากได้รับการรักษา 8 ชั่วโมง และจำนวนของช่องว่างเพิ่มขึ้นหลังจาก 12 ชั่วโมง พบช่องว่างขนาดใหญ่หลายแห่งหลังจาก 14 ชั่วโมง ช่องว่างที่หลอมรวมกันหลายแห่งมองเห็นได้อย่างชัดเจนหลังจากได้รับการรักษา 12–16 ชั่วโมง ซึ่งบ่งชี้ว่าการหลอมรวมของช่องว่างเป็นพื้นฐานของกลไกการตายแบบมีเทน หลังจาก 20 ชั่วโมง พบช่องว่างขนาดใหญ่หลายแห่งทั่วทั้งตัวไส้เดือน การสังเกตการณ์เหล่านี้ถือเป็นรายงานแรกเกี่ยวกับการเกิดเมทูโอซิสในหนอนตัวกลม C. elegans
ในหนอนที่ได้รับการรักษาด้วย 5-ไอโอโดอินโดล ยังพบการรวมตัวและการแตกของแวคิวโอลด้วย (รูปที่ 5) ดังที่เห็นได้จากการที่หนอนงอตัวและแวคิวโอลหลุดออกมาสู่สิ่งแวดล้อม นอกจากนี้ยังพบการแตกของแวคิวโอลในเยื่อหุ้มเปลือกไข่ ซึ่งโดยปกติแล้วจะยังคงสภาพสมบูรณ์ในระยะ L2 ระหว่างการฟักตัว (รูปเพิ่มเติม S2) การสังเกตเหล่านี้สนับสนุนการมีส่วนร่วมของการสะสมของเหลวและความล้มเหลวในการควบคุมสมดุลออสโมซิส รวมถึงการบาดเจ็บของเซลล์ที่สามารถกลับคืนสู่สภาพเดิมได้ (RCI) ในกระบวนการก่อตัวและการเกิดหนองของแวคิวโอล (รูปที่ 5)
จากการตั้งสมมติฐานเกี่ยวกับบทบาทของไอโอดีนในการก่อตัวของแวคิวโอลที่สังเกตได้ เราจึงตรวจสอบฤทธิ์ในการฆ่าไส้เดือนฝอยของโซเดียมไอโอไดด์ (NaI) และโพแทสเซียมไอโอไดด์ (KI) อย่างไรก็ตาม ที่ความเข้มข้น (0.1, 0.5 หรือ 1 มิลลิโมลาร์) สารเหล่านี้ไม่มีผลต่อการอยู่รอดของไส้เดือนฝอยหรือการก่อตัวของแวคิวโอล (ภาพประกอบเพิ่มเติม Fig. S5) แม้ว่า KI ที่ความเข้มข้น 1 มิลลิโมลาร์จะมีฤทธิ์ในการฆ่าไส้เดือนฝอยเล็กน้อย ในทางกลับกัน 7-ไอโอโดอินโดล (1 หรือ 2 มิลลิโมลาร์) เช่นเดียวกับ 5-ไอโอโดอินโดล กระตุ้นให้เกิดแวคิวโอลหลายแห่งและการเปลี่ยนแปลงโครงสร้าง (ภาพประกอบเพิ่มเติม Fig. S6) ไอโอโดอินโดลทั้งสองชนิดแสดงลักษณะทางฟีโนไทป์ที่คล้ายคลึงกันในไส้เดือนฝอยสน ในขณะที่ NaI และ KI ไม่เป็นเช่นนั้น ที่น่าสนใจคือ อินโดลไม่กระตุ้นให้เกิดการก่อตัวของแวคิวโอลใน B. xylophilus ที่ความเข้มข้นที่ทดสอบ (ข้อมูลไม่ได้แสดงไว้) ดังนั้น ผลการวิจัยจึงยืนยันว่าสารประกอบอินโดล-ไอโอดีนมีส่วนรับผิดชอบต่อการเกิดแวคิวโอลและการเผาผลาญของแบคทีเรีย B. xylophilus
ในบรรดาอินโดลที่ทดสอบฤทธิ์ในการกำจัดไส้เดือนฝอย 5-ไอโอโดอินโดลมีค่าดัชนีการลื่นไถลสูงสุดที่ -5.89 กิโลแคลอรี/โมล ตามด้วย 7-ไอโอโดอินโดล (-4.48 กิโลแคลอรี/โมล) 4-ฟลูออโรอินโดล (-4.33) และอินโดล (-4.03) (รูปที่ 6) พันธะไฮโดรเจนที่แข็งแรงของโครงสร้างหลักของ 5-ไอโอโดอินโดลกับลิวซีน 218 ช่วยให้การจับยึดมีเสถียรภาพ ในขณะที่อนุพันธ์อินโดลอื่นๆ ทั้งหมดจับกับซีรีน 260 ผ่านพันธะไฮโดรเจนของหมู่ข้างเคียง ในบรรดาไอโอโดอินโดลที่จำลองขึ้นนั้น 2-ไอโอโดอินโดลมีค่าการจับตัวอยู่ที่ -5.248 กิโลแคลอรี/โมล ซึ่งเป็นผลมาจากพันธะไฮโดรเจนหลักกับลิวซีน 218 การจับตัวที่ทราบอื่นๆ ได้แก่ 3-ไอโอโดอินโดล (-4.3 กิโลแคลอรี/โมล), 4-ไอโอโดอินโดล (-4.0 กิโลแคลอรี/โมล) และ 6-ฟลูออโรอินโดล (-2.6 กิโลแคลอรี/โมล) (ภาพประกอบเพิ่มเติม S8) อินโดลที่มีฮาโลเจนส่วนใหญ่และอินโดลเอง ยกเว้น 5-ไอโอโดอินโดลและ 2-ไอโอโดอินโดล จะสร้างพันธะกับซีรีน 260 ข้อเท็จจริงที่ว่าการสร้างพันธะไฮโดรเจนกับลิวซีน 218 บ่งชี้ถึงการจับกันระหว่างตัวรับและลิแกนด์ที่มีประสิทธิภาพ ดังที่สังเกตได้ในไอเวอร์เมกติน (ภาพประกอบเพิ่มเติม Fig. S7) ยืนยันว่า 5-ไอโอโดอินโดลและ 2-ไอโอโดอินโดล เช่นเดียวกับไอเวอร์เมกติน จับกับบริเวณออกฤทธิ์ของตัวรับ GluCL อย่างแน่นหนาผ่านทางลิวซีน 218 (รูปที่ 6 และภาพประกอบเพิ่มเติม Fig. S8) เราเสนอว่าการจับกันนี้จำเป็นต่อการรักษาสภาพโครงสร้างรูพรุนที่เปิดอยู่ของคอมเพล็กซ์ GluCL และด้วยการจับกับบริเวณออกฤทธิ์ของตัวรับ GluCL อย่างแน่นหนา 5-ไอโอโดอินโดล 2-ไอโอโดอินโดล อะเวอร์เมกติน และไอเวอร์เมกติน จึงช่วยรักษาช่องไอออนให้เปิดอยู่และอนุญาตให้มีการดูดซึมของเหลวได้
การจับกันของโมเลกุลอินโดลและอินโดลที่มีฮาโลเจนกับ GluCL การวางตัวของการจับกันของลิแกนด์ (A) อินโดล, (B) 4-ฟลูออโรอินโดล, (C) 7-ไอโอโดอินโดล และ (D) 5-ไอโอโดอินโดล กับบริเวณออกฤทธิ์ของ GluCL โปรตีนแสดงด้วยแถบ และพันธะไฮโดรเจนของโครงสร้างหลักแสดงด้วยเส้นประสีเหลือง (A′), (B′), (C′) และ (D′) แสดงปฏิสัมพันธ์ของลิแกนด์ที่เกี่ยวข้องกับหมู่กรดอะมิโนโดยรอบ และพันธะไฮโดรเจนของหมู่ข้างเคียงแสดงด้วยลูกศรจุดสีชมพู
การทดลองได้ดำเนินการเพื่อประเมินผลกระทบที่เป็นพิษของ 5-ไอโอโดอินโดลต่อการงอกของเมล็ดกะหล่ำปลีและหัวไชเท้า 5-ไอโอโดอินโดล (0.05 หรือ 0.1 มิลลิโมลาร์) หรืออะเวอร์เมกติน (10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) มีผลกระทบต่อการงอกเริ่มต้นและการเจริญเติบโตของต้นกล้าน้อยมากหรือไม่มีเลย (ภาพที่ 7) นอกจากนี้ ไม่พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างอัตราการงอกของกลุ่มควบคุมที่ไม่ได้รับการรักษาและเมล็ดที่ได้รับการรักษาด้วย 5-ไอโอโดอินโดลหรืออะเวอร์เมกติน ผลกระทบต่อการยืดตัวของรากแก้วและจำนวนรากแขนงที่เกิดขึ้นนั้นไม่มีนัยสำคัญ แม้ว่า 5-ไอโอโดอินโดลที่ความเข้มข้น 1 มิลลิโมลาร์ (10 เท่าของความเข้มข้นที่ออกฤทธิ์) จะทำให้การพัฒนาของรากแขนงช้าลงเล็กน้อย ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า 5-ไอโอโดอินโดลไม่เป็นพิษต่อเซลล์พืชและไม่รบกวนกระบวนการพัฒนาของพืชที่ความเข้มข้นที่ศึกษา
ผลของ 5-ไอโอโดอินโดลต่อการงอกของเมล็ด การงอก การแตกหน่อ และการเกิดรากแขนงของเมล็ด B. oleracea และ R. raphanistrum บนอาหารเลี้ยงเชื้อ Murashige and Skoog ที่มีหรือไม่มีอะเวอร์เมกตินหรือ 5-ไอโอโดอินโดล บันทึกการงอกหลังจากบ่มเป็นเวลา 3 วันที่อุณหภูมิ 22°C
งานวิจัยนี้รายงานกรณีการฆ่าไส้เดือนฝอยโดยสารอินโดลหลายกรณี ที่สำคัญคือ นี่เป็นรายงานแรกที่ระบุว่าไอโอโดอินโดลกระตุ้นให้เกิดกระบวนการเมทิลเลชัน (กระบวนการที่เกิดจากการสะสมของแวคิวโอลขนาดเล็กที่ค่อยๆ รวมตัวกันเป็นแวคิวโอลขนาดใหญ่ จนในที่สุดนำไปสู่การแตกของเยื่อหุ้มเซลล์และตาย) ในใบสน โดยไอโอโดอินโดลแสดงคุณสมบัติในการฆ่าไส้เดือนฝอยอย่างมีนัยสำคัญคล้ายกับสารฆ่าไส้เดือนฝอยทางการค้าอย่างอะเวอร์เมกติน
ก่อนหน้านี้มีรายงานว่าอินโดลทำหน้าที่ส่งสัญญาณหลายอย่างในโปรคาริโอตและยูคาริโอต รวมถึงการยับยั้ง/การก่อตัวของไบโอฟิล์ม การอยู่รอดของแบคทีเรีย และความสามารถในการก่อโรค19,32,33,34 เมื่อเร็วๆ นี้ ศักยภาพในการรักษาของอินโดลที่มีฮาโลเจน อินโดลอัลคาลอยด์ และอนุพันธ์อินโดลสังเคราะห์ ได้ดึงดูดความสนใจในการวิจัยอย่างกว้างขวาง35,36,37 ตัวอย่างเช่น อินโดลที่มีฮาโลเจนแสดงให้เห็นว่าสามารถฆ่าเซลล์ Escherichia coli และ Staphylococcus aureus ที่ดื้อยาได้37 นอกจากนี้ การศึกษาประสิทธิภาพของอินโดลที่มีฮาโลเจนต่อสายพันธุ์ สกุล และอาณาจักรอื่นๆ ก็เป็นที่น่าสนใจทางวิทยาศาสตร์ และการศึกษานี้เป็นก้าวหนึ่งไปสู่เป้าหมายนี้
ในที่นี้ เราเสนอกลไกการทำให้เกิดการตายใน C. elegans ที่เกิดจาก 5-iodoindole โดยอาศัยการบาดเจ็บของเซลล์ที่สามารถกลับคืนสู่สภาพเดิมได้ (RCI) และการเมทิลเลชัน (รูปที่ 4C และ 5) การเปลี่ยนแปลงที่ทำให้เกิดอาการบวม เช่น อาการบวมและภาวะเสื่อมสภาพของช่องว่าง เป็นตัวบ่งชี้ของ RCI และการเมทิลเลชัน ซึ่งปรากฏเป็นช่องว่างขนาดใหญ่ในไซโตพลาสซึม48,49 RCI รบกวนการผลิตพลังงานโดยการลดการผลิต ATP ทำให้ปั๊ม ATPase ล้มเหลว หรือทำลายเยื่อหุ้มเซลล์และทำให้เกิดการไหลเข้าอย่างรวดเร็วของ Na+, Ca2+ และน้ำ50,51,52 ช่องว่างภายในไซโตพลาสซึมเกิดขึ้นในเซลล์สัตว์อันเป็นผลมาจากการสะสมของของเหลวในไซโตพลาสซึมเนื่องจากการไหลเข้าของ Ca2+ และน้ำ53 ที่น่าสนใจคือ กลไกการทำลายเซลล์นี้สามารถย้อนกลับได้หากความเสียหายเป็นเพียงชั่วคราว และเซลล์จะเริ่มผลิต ATP ได้ในช่วงระยะเวลาหนึ่ง แต่หากความเสียหายยังคงอยู่หรือแย่ลง เซลล์ก็จะตาย54 การสังเกตของเราแสดงให้เห็นว่าหนอนตัวกลมที่ได้รับการรักษาด้วย 5-ไอโอโดอินโดลไม่สามารถฟื้นฟูการสังเคราะห์ทางชีวภาพตามปกติได้หลังจากได้รับสภาวะความเครียด
ฟีโนไทป์ของการเมทิลเลชันที่เกิดจาก 5-ไอโอโดอินโดลใน B. xylophilus อาจเนื่องมาจากการมีอยู่ของไอโอดีนและการกระจายตัวของโมเลกุล เนื่องจาก 7-ไอโอโดอินโดลมีผลยับยั้ง B. xylophilus น้อยกว่า 5-ไอโอโดอินโดล (ตารางที่ 1 และรูปภาพเสริม S6) ผลลัพธ์เหล่านี้สอดคล้องกับงานวิจัยของ Maltese et al. (2014) บางส่วน ซึ่งรายงานว่าการเคลื่อนย้ายหมู่ไนโตรเจนไพริดิลในอินโดลจากตำแหน่งพาราไปยังตำแหน่งเมตาทำให้การเกิดแวคิวโอล การยับยั้งการเจริญเติบโต และความเป็นพิษต่อเซลล์ในเซลล์ U251 หายไป ซึ่งแสดงให้เห็นว่าการโต้ตอบของโมเลกุลกับไซต์ที่ออกฤทธิ์เฉพาะในโปรตีนมีความสำคัญอย่างยิ่ง27,44,45 ปฏิสัมพันธ์ระหว่างอินโดลหรืออินโดลที่มีฮาโลเจนกับตัวรับ GluCL ที่สังเกตได้ในการศึกษานี้ยังสนับสนุนแนวคิดนี้ด้วย เนื่องจากพบว่า 5- และ 2-ไอโอโดอินโดลจับกับตัวรับ GluCL ได้อย่างแข็งแรงกว่าอินโดลอื่นๆ ที่ตรวจสอบ (รูปที่ 6 และรูปเพิ่มเติม S8) พบว่าไอโอดีนที่ตำแหน่งที่สองหรือห้าของอินโดลจับกับลิวซีน 218 ของตัวรับ GluCL ผ่านพันธะไฮโดรเจนของโครงสร้างหลัก ในขณะที่อินโดลที่มีฮาโลเจนอื่นๆ และอินโดลเองสร้างพันธะไฮโดรเจนของโซ่ข้างที่อ่อนแอร่วมกับซีรีน 260 (รูปที่ 6) ดังนั้นเราจึงคาดการณ์ว่าตำแหน่งของฮาโลเจนมีบทบาทสำคัญในการเหนี่ยวนำให้เกิดการเสื่อมสภาพของแวคิวโอล ในขณะที่การจับอย่างแน่นหนาของ 5-ไอโอโดอินโดลทำให้ช่องไอออนเปิดอยู่ ส่งผลให้ของเหลวไหลเข้าอย่างรวดเร็วและแวคิวโอลแตก อย่างไรก็ตาม กลไกการออกฤทธิ์โดยละเอียดของ 5-ไอโอโดอินโดลยังคงต้องได้รับการศึกษาเพิ่มเติม
ก่อนนำ 5-ไอโอโดอินโดลไปใช้ในทางปฏิบัติ ควรวิเคราะห์ผลกระทบที่เป็นพิษต่อพืชเสียก่อน การทดลองการงอกของเมล็ดของเราแสดงให้เห็นว่า 5-ไอโอโดอินโดลไม่มีผลเสียต่อการงอกของเมล็ดหรือกระบวนการเจริญเติบโตในภายหลังที่ความเข้มข้นที่ศึกษา (รูปที่ 7) ดังนั้น งานวิจัยนี้จึงเป็นพื้นฐานสำหรับการใช้ 5-ไอโอโดอินโดลในสภาพแวดล้อมทางนิเวศวิทยาเพื่อควบคุมอันตรายของไส้เดือนฝอยสนต่อต้นสน
รายงานก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าการบำบัดด้วยสารอินโดลเป็นแนวทางที่มีศักยภาพในการแก้ไขปัญหาการดื้อยาปฏิชีวนะและการลุกลามของมะเร็ง55 นอกจากนี้ อินโดลยังมีฤทธิ์ต้านแบคทีเรีย ต้านมะเร็ง ต้านอนุมูลอิสระ ต้านการอักเสบ ต้านเบาหวาน ต้านไวรัส ต้านการเจริญเติบโตของเซลล์ และต้านวัณโรค และอาจเป็นพื้นฐานที่น่าสนใจสำหรับการพัฒนายา56,57 การศึกษานี้เสนอเป็นครั้งแรกถึงศักยภาพในการใช้ไอโอดีนเป็นสารต้านปรสิตและยาถ่ายพยาธิ
อะเวอร์เมกตินถูกค้นพบเมื่อสามทศวรรษที่แล้วและได้รับรางวัลโนเบลในปี 2015 และการใช้อะเวอร์เมกตินเป็นยาถ่ายพยาธิยังคงดำเนินอยู่ อย่างไรก็ตาม เนื่องจากพยาธิและแมลงศัตรูพืชพัฒนาความต้านทานต่ออะเวอร์เมกตินอย่างรวดเร็ว จึงจำเป็นต้องมีกลยุทธ์ทางเลือกที่มีต้นทุนต่ำและเป็นมิตรต่อสิ่งแวดล้อมเพื่อควบคุมการติดเชื้อพยาธิไส้เดือนในต้นสน งานวิจัยนี้ยังรายงานกลไกที่ 5-ไอโอโดอินโดลฆ่าพยาธิไส้เดือนในต้นสน และพบว่า 5-ไอโอโดอินโดลมีพิษต่อเซลล์พืชต่ำ ซึ่งเปิดโอกาสที่ดีสำหรับการนำไปใช้ในเชิงพาณิชย์ในอนาคต
การทดลองทั้งหมดได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมของมหาวิทยาลัยยองนัม จังหวัดคยองซาน ประเทศเกาหลี และวิธีการดำเนินการเป็นไปตามแนวทางของคณะกรรมการจริยธรรมของมหาวิทยาลัยยองนัม
การทดลองฟักไข่ดำเนินการตามขั้นตอนที่กำหนดไว้แล้ว43 เพื่อประเมินอัตราการฟัก (HR) หนอนตัวกลมโตเต็มวัยอายุ 1 วัน (ประมาณ 100 ตัวเมียและ 100 ตัวผู้) ถูกย้ายไปยังจานเพาะเชื้อที่มีเชื้อราและปล่อยให้เจริญเติบโตเป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นจึงแยกไข่และบำบัดด้วย 5-ไอโอโดอินโดล (0.05 mM และ 0.1 mM) หรืออะเวอร์เมกติน (10 μg/ml) ในรูปสารแขวนลอยในน้ำกลั่นปราศจากเชื้อ สารแขวนลอยเหล่านี้ (500 μl; ประมาณ 100 ฟอง) ถูกถ่ายโอนไปยังหลุมของจานเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ 24 หลุมและบ่มที่ 22 °C นับจำนวนตัวอ่อนระยะ L2 หลังจากบ่ม 24 ชั่วโมง แต่ถือว่าตายหากเซลล์ไม่เคลื่อนไหวเมื่อถูกกระตุ้นด้วยลวดแพลทินัมเส้นเล็ก การทดลองนี้ดำเนินการในสองขั้นตอน แต่ละขั้นตอนทำซ้ำ 6 ครั้ง ข้อมูลจากทั้งสองการทดลองถูกรวมเข้าด้วยกันและนำเสนอ เปอร์เซ็นต์ของ HR คำนวณได้ดังนี้:
การประเมินอัตราการตายของตัวอ่อนใช้วิธีการที่พัฒนาขึ้นก่อนหน้านี้ เก็บไข่ของหนอนตัวกลมและทำให้ตัวอ่อนอยู่ในระยะ L2 พร้อมกันโดยการฟักในน้ำกลั่นปราศจากเชื้อ ตัวอ่อนที่อยู่ในระยะพร้อมกัน (ประมาณ 500 ตัว) ได้รับการบำบัดด้วย 5-ไอโอโดอินโดล (0.05 มิลลิโมลาร์ และ 0.1 มิลลิโมลาร์) หรืออะเวอร์เมกติน (10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) และเลี้ยงบนจานเพาะเชื้อ B. cinerea หลังจากบ่มเป็นเวลา 48 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 22 องศาเซลเซียส เก็บหนอนตัวกลมในน้ำกลั่นปราศจากเชื้อและตรวจสอบหาตัวอ่อนในระยะ L2, L3 และ L4 การพบตัวอ่อนในระยะ L3 และ L4 บ่งชี้ว่ามีการเปลี่ยนแปลงของตัวอ่อน ในขณะที่การพบตัวอ่อนในระยะ L2 บ่งชี้ว่าไม่มีการเปลี่ยนแปลง บันทึกภาพโดยใช้ระบบถ่ายภาพเซลล์ดิจิทัล iRiS™ การทดลองนี้ดำเนินการในสองขั้นตอน แต่ละขั้นตอนทำซ้ำ 6 ครั้ง ข้อมูลจากทั้งสองการทดลองถูกนำมารวมกันและนำเสนอ
การประเมินความเป็นพิษของ 5-ไอโอโดอินโดลและอะเวอร์เมกตินต่อเมล็ดพืชทำได้โดยใช้การทดสอบการงอกบนจานวุ้น Murashige and Skoog62 เมล็ด B. oleracea และ R. raphanistrum ถูกแช่ในน้ำกลั่นปราศจากเชื้อเป็นเวลาหนึ่งวัน ล้างด้วยเอทานอล 100% ปริมาณ 1 มล. ฆ่าเชื้อด้วยสารฟอกขาวเชิงพาณิชย์ 50% (โซเดียมไฮโปคลอไรต์ 3%) ปริมาณ 1 มล. เป็นเวลา 15 นาที และล้างด้วยน้ำปราศจากเชื้อปริมาณ 1 มล. จำนวนห้าครั้ง จากนั้นเมล็ดที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วถูกกดลงบนจานวุ้นสำหรับการงอกที่มีอาหารเลี้ยงเชื้อ Murashige and Skoog 0.86 กรัม/ลิตร (0.2X) และวุ้นแบคทีเรีย 0.7% โดยมีหรือไม่มี 5-ไอโอโดอินโดลหรืออะเวอร์เมกติน จากนั้นนำจานไปบ่มที่อุณหภูมิ 22 °C และถ่ายภาพหลังจากบ่มเป็นเวลา 3 วัน การทดลองนี้ดำเนินการในสองขั้นตอน โดยแต่ละขั้นตอนมีการทำซ้ำหกครั้ง