การประเมินไอโอดีนและอะเวอร์เมกตินเป็นตัวเหนี่ยวนำโรคไส้เดือนฝอยในต้นสน

ไส้เดือนฝอยสนเป็นปรสิตภายในที่อพยพเข้ามากักกันซึ่งทราบกันดีว่าก่อให้เกิดความสูญเสียทางเศรษฐกิจอย่างรุนแรงในระบบนิเวศป่าสน การศึกษานี้ทบทวนกิจกรรมของไส้เดือนฝอยของอินโดลที่มีฮาโลเจนต่อไส้เดือนฝอยสนและกลไกการออกฤทธิ์ กิจกรรมของไส้เดือนฝอยสนของ 5-ไอโอโดอินโดลและอาเวอร์เมกติน (ตัวควบคุมเชิงบวก) คล้ายคลึงกันและสูงที่ความเข้มข้นต่ำ (10 μg/mL) 5-ไอโอโดอินโดลลดความสามารถในการสืบพันธุ์ กิจกรรมการสืบพันธุ์ การตายของตัวอ่อนและตัวอ่อน และพฤติกรรมการเคลื่อนไหว ปฏิสัมพันธ์ทางโมเลกุลของลิแกนด์กับตัวรับช่องคลอไรด์ที่ควบคุมด้วยกลูตาเมตเฉพาะของสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลังสนับสนุนแนวคิดที่ว่า 5-ไอโอโดอินโดล เช่นเดียวกับอาเวอร์เมกติน จับกับตำแหน่งที่ใช้งานของตัวรับอย่างแน่นหนา 5-ไอโอโดอินโดลยังกระตุ้นให้เกิดการผิดรูปทางฟีโนไทป์ต่างๆ ในไส้เดือนฝอย รวมถึงการยุบตัว/หดตัวของอวัยวะที่ผิดปกติและการสร้างช่องว่างเพิ่มขึ้น ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าช่องว่างอาจมีบทบาทในการตายที่เกิดจากกระบวนการเมทิลเลชันของไส้เดือนฝอย ที่สำคัญ 5-ไอโอโดอินโดลไม่เป็นพิษต่อพืชทั้งสองชนิด (กะหล่ำปลีและหัวไชเท้า) ดังนั้น การศึกษานี้จึงแสดงให้เห็นว่าการใช้ไอโอโดอินโดลภายใต้สภาวะแวดล้อมสามารถควบคุมการบาดเจ็บจากโรคเหี่ยวเฉาของต้นสนได้
ไส้เดือนฝอยในไม้สน (Bursaphelenchus xylophilus) เป็นไส้เดือนฝอยในไม้สน (Pinewood nematodes: PWN) ซึ่งเป็นไส้เดือนฝอยที่อพยพย้ายถิ่นฐานและก่อความเสียหายต่อระบบนิเวศของป่าสนอย่างรุนแรง1 โรคเหี่ยวเฉาของต้นสน (PWD) ที่เกิดจากไส้เดือนฝอยในไม้สนกำลังกลายเป็นปัญหาที่ร้ายแรงในหลายทวีป รวมถึงเอเชียและยุโรป และในอเมริกาเหนือ ไส้เดือนฝอยได้ทำลายพันธุ์สนที่นำเข้ามา1,2 การเสื่อมโทรมของต้นสนเป็นปัญหาเศรษฐกิจที่สำคัญ และแนวโน้มการแพร่กระจายไปทั่วโลกนั้นน่าเป็นห่วง3 พันธุ์สนต่อไปนี้มักถูกไส้เดือนฝอยโจมตีมากที่สุด: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii และ Pinus radiata4 ไส้เดือนฝอยในไม้สนเป็นโรคร้ายแรงที่สามารถฆ่าต้นสนได้ภายในไม่กี่สัปดาห์หรือไม่กี่เดือนหลังจากติดเชื้อ นอกจากนี้ การระบาดของไส้เดือนฝอยในสนยังพบได้ทั่วไปในระบบนิเวศหลายประเภท จึงทำให้เกิดห่วงโซ่การติดเชื้อที่ต่อเนื่องกัน1
Bursaphelenchus xylophilus เป็นไส้เดือนฝอยปรสิตพืชที่กักกันซึ่งอยู่ในวงศ์ย่อย Aphelenchoidea และกลุ่ม 102.5 ไส้เดือนฝอยกินเชื้อราและขยายพันธุ์ในเนื้อเยื่อไม้ของต้นสน โดยพัฒนาเป็นตัวอ่อน 4 ระยะ ได้แก่ L1, L2, L3, L4 และตัวเต็มวัย1,6 ในสภาวะที่ขาดแคลนอาหาร ไส้เดือนฝอยสนจะเข้าสู่ระยะตัวอ่อนเฉพาะ – dauer ซึ่งอาศัยอยู่กับแมลงพาหะ – ด้วงเปลือกสน (Monochamus alternatus) และย้ายไปยังต้นสนที่แข็งแรง ในโฮสต์ที่แข็งแรง ไส้เดือนฝอยจะอพยพผ่านเนื้อเยื่อพืชอย่างรวดเร็วและกินเซลล์เนื้อเยื่อ ซึ่งนำไปสู่ปฏิกิริยาไวเกินหลายอย่าง ต้นสนเหี่ยวเฉา และตายภายในหนึ่งปีหลังจากติดเชื้อ1,7,8
การควบคุมไส้เดือนฝอยในสนด้วยชีววิทยาเป็นความท้าทายมาช้านาน โดยมีมาตรการกักกันตั้งแต่ศตวรรษที่ 20 กลยุทธ์ปัจจุบันในการควบคุมไส้เดือนฝอยในสนส่วนใหญ่เกี่ยวข้องกับการบำบัดทางเคมี เช่น การรมควันไม้และการฝังไส้เดือนฝอยในลำต้นไม้ ไส้เดือนฝอยที่ใช้กันทั่วไป ได้แก่ อะเวอร์เมกตินและอะเวอร์เมกตินเบนโซเอต ซึ่งอยู่ในตระกูลอะเวอร์เมกติน สารเคมีราคาแพงเหล่านี้มีประสิทธิภาพสูงในการกำจัดไส้เดือนฝอยหลายชนิดและถือว่าปลอดภัยต่อสิ่งแวดล้อม9 อย่างไรก็ตาม การใช้ไส้เดือนฝอยซ้ำๆ กันคาดว่าจะสร้างแรงกดดันในการคัดเลือกซึ่งเกือบจะนำไปสู่การเกิดไส้เดือนฝอยสนที่ต้านทานได้อย่างแน่นอน ซึ่งได้มีการพิสูจน์แล้วในแมลงศัตรูพืชหลายชนิด เช่น Leptinotarsa ​​​​decemlineata, Plutella xylostella และไส้เดือนฝอย Trichostrongylus colubriformis และ Ostertagia circumcincta ซึ่งค่อยๆ พัฒนาความต้านทานต่ออะเวอร์เมกติน10,11,12 ดังนั้น จำเป็นต้องมีการศึกษารูปแบบความต้านทานและคัดกรองสารกำจัดไส้เดือนฝอยอย่างสม่ำเสมอ เพื่อค้นหาวิธีการควบคุม PVD ทางเลือกที่คุ้มต้นทุนและเป็นมิตรต่อสิ่งแวดล้อม ในช่วงหลายทศวรรษที่ผ่านมา ผู้เขียนหลายคนเสนอให้ใช้สารสกัดจากพืช น้ำมันหอมระเหย และสารระเหยเป็นสารควบคุมไส้เดือนฝอย13,14,15,16
เมื่อไม่นานนี้ เราได้สาธิตการทำงานของเนมาติไซด์ของอินโดล ซึ่งเป็นโมเลกุลส่งสัญญาณระหว่างเซลล์และระหว่างอาณาจักร ใน Caenorhabditis elegans 17 อินโดลเป็นสัญญาณภายในเซลล์ที่แพร่หลายในระบบนิเวศของจุลินทรีย์ โดยควบคุมการทำงานต่างๆ มากมายที่ส่งผลต่อสรีรวิทยาของจุลินทรีย์ การสร้างสปอร์ ความเสถียรของพลาสมิด การดื้อยา การสร้างไบโอฟิล์ม และความรุนแรง 18, 19 ยังไม่มีการศึกษาการทำงานของอินโดลและอนุพันธ์ต่อไส้เดือนฝอยก่อโรคชนิดอื่นๆ ในการศึกษานี้ เราได้ตรวจสอบการทำงานของเนมาติไซด์ของอินโดล 34 ชนิดต่อไส้เดือนฝอยต้นสน และอธิบายกลไกการทำงานของ 5-ไอโอโดอินโดลที่มีฤทธิ์แรงที่สุดโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ การถ่ายภาพแบบไทม์แลปส์ และการทดลองการเชื่อมต่อโมเลกุล และประเมินผลกระทบที่เป็นพิษต่อพืชโดยใช้การทดสอบการงอกของเมล็ด
รายงานก่อนหน้านี้ระบุว่าความเข้มข้นสูงของอินโดล (>1.0 มิลลิโมลาร์) มีผลต่อการก่อเนมาทิดต่อไส้เดือนฝอย17 หลังจากการบำบัด B. xylophilus (ระยะชีวิตผสม) ด้วยอินโดลหรืออนุพันธ์อินโดล 33 ชนิดที่ความเข้มข้น 1 มิลลิโมลาร์ อัตราการตายของ B. xylophilus ถูกวัดโดยการนับไส้เดือนฝอยที่มีชีวิตและตายในกลุ่มควบคุมและกลุ่มที่บำบัด อินโดล 5 ชนิดแสดงกิจกรรมก่อเนมาทิดอย่างมีนัยสำคัญ อัตราการรอดชีวิตของกลุ่มควบคุมที่ไม่บำบัดคือ 95 ± 7% หลังจาก 24 ชั่วโมง จากอินโดล 34 ชนิดที่ทดสอบ 5-ไอโอโดอินโดลและ 4-ฟลูออโรอินโดลที่ความเข้มข้น 1 มิลลิโมลาร์ทำให้มีอัตราการตาย 100% ในขณะที่ 5,6-ไดฟลูออโรอินดิโก เมทิลอินโดล-7-คาร์บอกซิเลต และ 7-ไอโอโดอินโดลทำให้มีอัตราการตายประมาณ 50% (ตารางที่ 1)
ผลของ 5-ไอโอโดอินโดลต่อการสร้างช่องว่างและการเผาผลาญของไส้เดือนฝอยในไม้สน (A) ผลของอะเวอร์เมกตินและ 5-ไอโอโดอินโดลต่อไส้เดือนฝอยตัวผู้โตเต็มวัย (B) ไข่ไส้เดือนฝอยระยะ L1 และ (C) การเผาผลาญของ B. xylophilus (i) ไม่พบช่องว่างที่ 0 ชั่วโมง การบำบัดส่งผลให้เกิด (ii) ช่องว่าง (iii) ช่องว่างสะสมหลายช่อง (iv) ช่องว่างบวม (v) ช่องว่างหลอมรวม และ (vi) การก่อตัวของช่องว่างยักษ์ ลูกศรสีแดงแสดงถึงช่องว่างบวม ลูกศรสีน้ำเงินแสดงถึงช่องว่างหลอมรวม และลูกศรสีดำแสดงถึงช่องว่างยักษ์ มาตราส่วน = 50 ไมโครเมตร
นอกจากนี้ การศึกษานี้ยังได้บรรยายถึงกระบวนการต่อเนื่องของการตายของไส้เดือนฝอยสนที่เกิดจากมีเทน (รูปที่ 4C) ความตายจากมีเทนเป็นการตายของเซลล์แบบไม่เกิดอะพอพโทซิสซึ่งเกี่ยวข้องกับการสะสมของช่องว่างในไซโทพลาสซึมที่โดดเด่น27 ข้อบกพร่องทางสัณฐานวิทยาที่สังเกตพบในไส้เดือนฝอยสนดูเหมือนจะมีความเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับกลไกของความตายที่เกิดจากมีเทน การตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ในช่วงเวลาต่างๆ พบว่ามีการสร้างช่องว่างขนาดใหญ่หลังจากสัมผัสกับ 5-ไอโอโดอินโดล (0.1 มิลลิโมลาร์) เป็นเวลา 20 ชั่วโมง พบช่องว่างขนาดเล็กหลังจากการรักษา 8 ชั่วโมง และจำนวนเพิ่มขึ้นหลังจาก 12 ชั่วโมง พบช่องว่างขนาดใหญ่หลายช่องหลังจากการรักษา 14 ชั่วโมง มองเห็นช่องว่างที่เชื่อมติดกันหลายช่องได้ชัดเจนหลังจากการรักษา 12–16 ชั่วโมง ซึ่งบ่งชี้ว่าช่องว่างที่เชื่อมติดกันเป็นพื้นฐานของกลไกการตายของมีเทน หลังจาก 20 ชั่วโมง พบช่องว่างขนาดใหญ่หลายช่องทั่วทั้งไส้เดือน การสังเกตการณ์เหล่านี้ถือเป็นการรายงานครั้งแรกของ metuosis ใน C. elegans
ในหนอนที่ได้รับการรักษาด้วย 5-ไอโอโดอินโดล ยังสังเกตเห็นการรวมตัวและการแตกของช่องว่าง (รูปที่ 5) ซึ่งเห็นได้จากการโค้งงอของหนอนและการปล่อยช่องว่างออกสู่สิ่งแวดล้อม นอกจากนี้ยังสังเกตเห็นการแตกของช่องว่างในเยื่อเปลือกไข่ ซึ่งปกติจะคงสภาพสมบูรณ์ด้วย L2 ในระหว่างการฟักไข่ (รูปเสริม S2) การสังเกตเหล่านี้สนับสนุนการมีส่วนร่วมของการสะสมของของเหลวและความล้มเหลวในการควบคุมความเข้มข้นของออสโมซิส รวมถึงการบาดเจ็บของเซลล์ที่กลับคืนได้ (RCI) ในกระบวนการสร้างช่องว่างและการซึม (รูปที่ 5)
จากการตั้งสมมติฐานถึงบทบาทของไอโอดีนในการก่อตัวของช่องว่างที่สังเกตพบ เราได้ศึกษากิจกรรมเนมาติไซด์ของโซเดียมไอโอไดด์ (NaI) และโพแทสเซียมไอโอไดด์ (KI) อย่างไรก็ตาม ที่ความเข้มข้น (0.1, 0.5 หรือ 1 มิลลิโมลาร์) สารเหล่านี้ไม่มีผลต่อการอยู่รอดของเนมาติไซด์หรือการก่อตัวของช่องว่าง (ภาพเสริม S5) แม้ว่า KI 1 มิลลิโมลาร์จะมีผลต่อเนมาติไซด์เล็กน้อย ในทางกลับกัน 7-ไอโอโดอินโดล (1 หรือ 2 มิลลิโมลาร์) เช่นเดียวกับ 5-ไอโอโดอินโดล ทำให้เกิดช่องว่างจำนวนมากและโครงสร้างผิดรูป (ภาพเสริม S6) ไอโอโดอินโดลทั้งสองชนิดแสดงลักษณะทางฟีโนไทป์ที่คล้ายคลึงกันในเนมาติไซด์สน ในขณะที่ NaI และ KI ไม่เป็นเช่นนั้น ที่น่าสนใจคือ อินโดลไม่ได้กระตุ้นการก่อตัวของช่องว่างใน B. xylophilus ที่ความเข้มข้นที่ทดสอบ (ไม่มีการแสดงข้อมูล) ดังนั้นผลการศึกษาจึงยืนยันว่าสารประกอบอินโดลไอโอดีนมีหน้าที่ในการสร้างช่องว่างและการเผาผลาญของ B. xylophilus
ในกลุ่มอินโดลที่ทดสอบฤทธิ์เนมาทิดัล 5-ไอโอโดอินโดลมีดัชนีการลื่นสูงสุดที่ -5.89 กิโลแคลอรีต่อโมล รองลงมาคือ 7-ไอโอโดอินโดล (-4.48 กิโลแคลอรีต่อโมล) 4-ฟลูออโรอินโดล (-4.33) และอินโดล (-4.03) (รูปที่ 6) พันธะไฮโดรเจนแกนหลักที่แข็งแกร่งของ 5-ไอโอโดอินโดลกับลิวซีน 218 จะทำให้การจับกันมีเสถียรภาพ ในขณะที่อนุพันธ์อินโดลอื่นๆ ทั้งหมดจะจับกับเซอรีน 260 ผ่านพันธะไฮโดรเจนของโซ่ข้าง ในบรรดาไอโอโดอินโดลจำลองอื่นๆ 2-ไอโอโดอินโดลมีค่าการจับยึดอยู่ที่ -5.248 กิโลแคลอรีต่อโมล ซึ่งเกิดจากพันธะไฮโดรเจนหลักกับลิวซีน 218 การจับยึดอื่นๆ ที่ทราบได้แก่ 3-ไอโอโดอินโดล (-4.3 กิโลแคลอรีต่อโมล) 4-ไอโอโดอินโดล (-4.0 กิโลแคลอรีต่อโมล) และ 6-ฟลูออโรอินโดล (-2.6 กิโลแคลอรีต่อโมล) (รูปเสริมที่ S8) อินโดลฮาโลเจนส่วนใหญ่และอินโดลเอง ยกเว้น 5-ไอโอโดอินโดลและ 2-ไอโอโดอินโดล จะสร้างพันธะกับเซอรีน 260 ความจริงที่ว่าพันธะไฮโดรเจนกับลิวซีน 218 บ่งชี้ถึงการจับกันระหว่างตัวรับและลิแกนด์ที่มีประสิทธิภาพ ดังที่สังเกตในไอเวอร์เมกติน (รูปเสริม S7) ยืนยันว่า 5-ไอโอโดอินโดลและ 2-ไอโอโดอินโดล เช่นเดียวกับไอเวอร์เมกติน จับกันแน่นกับบริเวณที่ทำงานของตัวรับ GluCL ผ่านลิวซีน 218 (รูปที่ 6 และรูปเสริม S8) เราเสนอว่าการจับกันนี้จำเป็นต่อการรักษาโครงสร้างรูพรุนที่เปิดอยู่ของคอมเพล็กซ์ GluCL และด้วยการจับกันแน่นกับบริเวณที่ทำงานของตัวรับ GluCL 5-ไอโอโดอินโดล 2-ไอโอโดอินโดล อาเวอร์เมกติน และไอเวอร์เมกติน จึงรักษาช่องไอออนให้เปิดอยู่และให้ของเหลวถูกดูดซึมได้
การเชื่อมต่อโมเลกุลของอินโดลและอินโดลฮาโลจิเนตกับ GluCL ทิศทางการจับของลิแกนด์ (A) อินโดล (B) 4-ฟลูออโรอินโดล (C) 7-ไอโอโดอินโดล และ (D) 5-ไอโอโดอินโดลกับตำแหน่งที่ใช้งานของ GluCL โปรตีนแสดงด้วยริบบิ้น และพันธะไฮโดรเจนของแกนหลักแสดงด้วยเส้นประสีเหลือง (A′), (B′), (C′) และ (D′) แสดงปฏิสัมพันธ์ของลิแกนด์ที่สอดคล้องกับกรดอะมิโนที่อยู่โดยรอบ และพันธะไฮโดรเจนของโซ่ข้างแสดงด้วยลูกศรประสีชมพู
การทดลองได้ดำเนินการเพื่อประเมินผลพิษของ 5-ไอโอโดอินโดลต่อการงอกของเมล็ดกะหล่ำปลีและหัวไชเท้า 5-ไอโอโดอินโดล (0.05 หรือ 0.1 มิลลิโมลาร์) หรืออาเวอร์เมกติน (10 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร) มีผลเพียงเล็กน้อยหรือไม่มีเลยต่อการงอกในระยะเริ่มต้นและการงอกของต้นอ่อน (รูปที่ 7) นอกจากนี้ ยังไม่พบความแตกต่างที่สำคัญระหว่างอัตราการงอกของเมล็ดพืชควบคุมที่ไม่ได้รับการบำบัดกับเมล็ดพืชที่ได้รับการบำบัดด้วย 5-ไอโอโดอินโดลหรืออาเวอร์เมกติน ผลกระทบต่อการยืดตัวของรากแก้วและจำนวนรากข้างที่เกิดขึ้นไม่มีนัยสำคัญ แม้ว่า 5-ไอโอโดอินโดล 1 มิลลิโมลาร์ (10 เท่าของความเข้มข้นที่ออกฤทธิ์) จะทำให้การพัฒนาของรากข้างล่าช้าเล็กน้อย ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า 5-ไอโอโดอินโดลไม่เป็นพิษต่อเซลล์พืชและไม่รบกวนกระบวนการพัฒนาของพืชในความเข้มข้นที่ศึกษา
ผลของ 5-ไอโอโดอินโดลต่อการงอกของเมล็ด การงอก การแตกหน่อ และการแตกรากด้านข้างของเมล็ด B. oleracea และ R. raphanistrum บนอาหารเลี้ยงเชื้อ Murashige และ Skoog ที่มีหรือไม่มี avermectin หรือ 5-ไอโอโดอินโดล บันทึกการงอกหลังจากฟักที่อุณหภูมิ 22°C เป็นเวลา 3 วัน
การศึกษาครั้งนี้รายงานกรณีการฆ่าตัวกลมหลายกรณีด้วยอินโดล ที่สำคัญ นี่เป็นรายงานครั้งแรกที่ไอโอโดอินโดลกระตุ้นการเมทิลเลชัน (กระบวนการที่เกิดจากการสะสมของช่องว่างขนาดเล็กที่ค่อยๆ รวมเข้าด้วยกันเป็นช่องว่างขนาดใหญ่ ซึ่งในที่สุดนำไปสู่การแตกของเยื่อหุ้มเซลล์และการตายของเซลล์) ในใบสน โดยไอโอโดอินโดลแสดงคุณสมบัติในการจับตัวเป็นเนมาทิดที่สำคัญคล้ายกับคุณสมบัติของเนมาทิดไซด์ที่วางจำหน่ายในท้องตลาดอย่างอาเวอร์เมกติน
ก่อนหน้านี้มีรายงานว่าอินโดลมีหน้าที่ส่งสัญญาณหลายอย่างในโพรคาริโอตและยูคาริโอต รวมถึงการยับยั้ง/สร้างไบโอฟิล์ม การอยู่รอดของแบคทีเรีย และการก่อโรค19,32,33,34 เมื่อไม่นานมานี้ ผลการรักษาที่มีศักยภาพของอินโดลฮาโลเจน อัลคาลอยด์อินโดล และอนุพันธ์อินโดลกึ่งสังเคราะห์ดึงดูดความสนใจจากการวิจัยอย่างกว้างขวาง35,36,37 ตัวอย่างเช่น อินโดลฮาโลเจนได้รับการพิสูจน์แล้วว่าสามารถฆ่าเซลล์ Escherichia coli และ Staphylococcus aureus ที่คงอยู่ได้37 นอกจากนี้ การศึกษาประสิทธิภาพของอินโดลฮาโลเจนต่อสปีชีส์ สกุล และอาณาจักรอื่นๆ ถือเป็นเรื่องที่น่าสนใจทางวิทยาศาสตร์ และการศึกษาครั้งนี้ถือเป็นก้าวหนึ่งในการบรรลุเป้าหมายดังกล่าว
ที่นี่ เราเสนอกลไกสำหรับการเสียชีวิตที่เกิดจาก 5-ไอโอโดอินโดลใน C. elegans โดยอาศัยการบาดเจ็บของเซลล์แบบกลับคืนได้ (RCI) และการเมทิลเลชัน (รูปที่ 4C และ 5) การเปลี่ยนแปลงที่ทำให้เกิดอาการบวมน้ำ เช่น อาการบวมและการเสื่อมของช่องว่างเป็นตัวบ่งชี้ของ RCI และการเมทิลเลชัน ซึ่งแสดงออกมาในรูปของช่องว่างขนาดใหญ่ในไซโตพลาซึม48,49 RCI ขัดขวางการผลิตพลังงานโดยลดการผลิต ATP ทำให้ปั๊ม ATPase ล้มเหลว หรือทำลายเยื่อหุ้มเซลล์และทำให้เกิดการไหลเข้าอย่างรวดเร็วของ Na+, Ca2+ และน้ำ50,51,52 ช่องว่างภายในเซลล์เกิดขึ้นในเซลล์สัตว์อันเป็นผลจากการสะสมของของเหลวในไซโตพลาซึมอันเนื่องมาจากการไหลเข้าของ Ca2+ และน้ำ53 ที่น่าสนใจคือกลไกการทำลายเซลล์นี้สามารถกลับคืนได้หากความเสียหายเป็นเพียงชั่วคราวและเซลล์เริ่มผลิต ATP ในช่วงระยะเวลาหนึ่ง แต่หากความเสียหายยังคงอยู่หรือแย่ลง เซลล์ก็จะตาย54 จากการสังเกตของเราแสดงให้เห็นว่าไส้เดือนฝอยที่ได้รับการบำบัดด้วย 5-ไอโอโดอินโดลไม่สามารถฟื้นฟูการสังเคราะห์ทางชีวภาพตามปกติหลังจากสัมผัสกับสภาวะกดดันได้
ฟีโนไทป์เมทิลเลชันที่เหนี่ยวนำโดย 5-ไอโอโดอินโดลใน B. xylophilus อาจเกิดจากการมีอยู่ของไอโอดีนและการกระจายตัวของโมเลกุล เนื่องจาก 7-ไอโอโดอินโดลมีผลยับยั้ง B. xylophilus น้อยกว่า 5-ไอโอโดอินโดล (ตารางที่ 1 และรูปเสริม S6) ผลลัพธ์เหล่านี้สอดคล้องบางส่วนกับการศึกษาของ Maltese et al. (2014) ซึ่งรายงานว่าการเคลื่อนย้ายของกลุ่มไนโตรเจนไพริดิลในอินโดลจากพารา- โพลาไรเซชันไปยังเมตา- โพลาไรเซชันทำให้การสร้างช่องว่าง การยับยั้งการเจริญเติบโต และความเป็นพิษต่อเซลล์ U251 ลดลง ซึ่งบ่งชี้ว่าปฏิสัมพันธ์ระหว่างโมเลกุลกับตำแหน่งที่ใช้งานเฉพาะในโปรตีนมีความสำคัญอย่างยิ่ง27,44,45 ปฏิสัมพันธ์ระหว่างอินโดลหรืออินโดลฮาโลเจนและตัวรับ GluCL ที่สังเกตพบในการศึกษานี้ยังสนับสนุนแนวคิดนี้ด้วย เนื่องจากพบว่า 5- และ 2-ไอโอโดอินโดลจับกับตัวรับ GluCL ได้แรงกว่าอินโดลอื่นๆ ที่ตรวจสอบ (รูปที่ 6 และรูปเสริม S8) พบว่าไอโอดีนที่ตำแหน่งที่สองหรือที่ห้าของอินโดลจับกับลิวซีน 218 ของตัวรับ GluCL ผ่านพันธะไฮโดรเจนของแกนหลัก ในขณะที่อินโดลฮาโลเจนอื่นๆ และอินโดลเองสร้างพันธะไฮโดรเจนของโซ่ข้างที่อ่อนแอกับเซอรีน 260 (รูปที่ 6) ดังนั้นเราจึงคาดเดาว่าตำแหน่งของฮาโลเจนมีบทบาทสำคัญในการเหนี่ยวนำการเสื่อมของช่องว่าง ในขณะที่การจับกันแน่นของ 5-ไอโอโดอินโดลทำให้ช่องไอออนเปิดอยู่ จึงทำให้ของเหลวไหลเข้าอย่างรวดเร็วและช่องว่างแตก อย่างไรก็ตาม กลไกการออกฤทธิ์โดยละเอียดของ 5-ไอโอโดอินโดลยังคงต้องได้รับการกำหนด
ก่อนจะนำ 5-ไอโอโดอินโดลไปใช้จริง เราควรวิเคราะห์ผลพิษของ 5-ไอโอโดอินโดลที่มีต่อพืชเสียก่อน จากการทดลองการงอกของเมล็ดพืชพบว่า 5-ไอโอโดอินโดลไม่มีผลเสียต่อการงอกของเมล็ดพืชหรือกระบวนการพัฒนาในภายหลังที่ความเข้มข้นที่ศึกษา (รูปที่ 7) ดังนั้น การศึกษานี้จึงเป็นพื้นฐานสำหรับการใช้ 5-ไอโอโดอินโดลในสภาพแวดล้อมทางนิเวศน์เพื่อควบคุมอันตรายของไส้เดือนฝอยในต้นสน
รายงานก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าการบำบัดด้วยอินโดลเป็นแนวทางที่มีศักยภาพในการแก้ไขปัญหาการดื้อยาปฏิชีวนะและการลุกลามของมะเร็ง55 นอกจากนี้ อินโดลยังมีฤทธิ์ต้านแบคทีเรีย ต้านมะเร็ง ต้านอนุมูลอิสระ ต้านการอักเสบ ต้านเบาหวาน ต้านไวรัส ต้านการแพร่กระจายของเซลล์ และต้านวัณโรค และอาจเป็นพื้นฐานที่มีแนวโน้มดีสำหรับการพัฒนายา56,57 การศึกษานี้ชี้ให้เห็นถึงศักยภาพในการใช้ไอโอดีนเป็นยาต้านปรสิตและยาถ่ายพยาธิเป็นครั้งแรก
สารอะเวอร์เมกตินถูกค้นพบเมื่อสามทศวรรษก่อนและได้รับรางวัลโนเบลในปี 2015 และยังคงถูกนำมาใช้เป็นยาถ่ายพยาธิอย่างต่อเนื่อง อย่างไรก็ตาม เนื่องจากความต้านทานต่ออะเวอร์เมกตินในไส้เดือนฝอยและแมลงศัตรูพืชมีการพัฒนาอย่างรวดเร็ว จึงจำเป็นต้องมีกลยุทธ์ทางเลือกที่มีต้นทุนต่ำและเป็นมิตรต่อสิ่งแวดล้อมเพื่อควบคุมการติดเชื้อ PWN ในต้นสน การศึกษานี้ยังรายงานกลไกที่ 5-ไอโอโดอินโดลฆ่าไส้เดือนฝอยในต้นสน และพบว่า 5-ไอโอโดอินโดลมีพิษต่อเซลล์พืชต่ำ ซึ่งเปิดโอกาสให้มีการนำไปใช้ในเชิงพาณิชย์ในอนาคต
การทดลองทั้งหมดได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมของมหาวิทยาลัย Yeungnam จังหวัด Gyeongsan ประเทศเกาหลีใต้ และดำเนินการวิธีการตามแนวทางของคณะกรรมการจริยธรรมของมหาวิทยาลัย Yeungnam
การทดลองฟักไข่ได้ดำเนินการโดยใช้ขั้นตอนที่กำหนดไว้43 เพื่อประเมินอัตราการฟัก (HR) ไส้เดือนฝอยตัวเต็มวัยอายุ 1 วัน (ตัวเมียประมาณ 100 ตัวและตัวผู้ 100 ตัว) ถูกย้ายไปยังจานเพาะเชื้อที่มีเชื้อราและปล่อยให้เติบโตเป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นจึงแยกไข่และบำบัดด้วย 5-ไอโอโดอินโดล (0.05 มิลลิโมลาร์และ 0.1 มิลลิโมลาร์) หรืออะเวอร์เมกติน (10 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร) เป็นสารแขวนลอยในน้ำกลั่นที่ผ่านการฆ่าเชื้อ สารแขวนลอยเหล่านี้ (500 ไมโครลิตร ประมาณ 100 ฟอง) ถูกย้ายไปยังหลุมของจานเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ 24 หลุมและฟักที่อุณหภูมิ 22 องศาเซลเซียส นับ L2 หลังจากฟักเป็นเวลา 24 ชั่วโมง แต่ถือว่าเซลล์ตายหากเซลล์ไม่เคลื่อนที่เมื่อกระตุ้นด้วยลวดแพลตตินัมละเอียด การทดลองนี้ดำเนินการเป็นสองขั้นตอน โดยแต่ละขั้นตอนมีการทำซ้ำ 6 ครั้ง ข้อมูลจากการทดลองทั้งสองครั้งถูกนำมารวมกันและนำเสนอ เปอร์เซ็นต์ของ HR คำนวณได้ดังนี้:
การตายของตัวอ่อนได้รับการประเมินโดยใช้ขั้นตอนที่พัฒนาขึ้นก่อนหน้านี้ โดยเก็บไข่ไส้เดือนฝอยและทำการซิงโครไนซ์เอ็มบริโอด้วยการฟักในน้ำกลั่นที่ผ่านการฆ่าเชื้อเพื่อสร้างตัวอ่อนระยะ L2 ตัวอ่อนที่ซิงโครไนซ์ (ประมาณ 500 ตัว) จะได้รับการบำบัดด้วย 5-ไอโอโดอินโดล (0.05 มิลลิโมลาร์และ 0.1 มิลลิโมลาร์) หรืออาเวอร์เมกติน (10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) และเลี้ยงบนจานเพาะเชื้อ B. cinerea หลังจากฟักที่อุณหภูมิ 22 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 48 ชั่วโมงแล้ว จึงเก็บไส้เดือนฝอยในน้ำกลั่นที่ผ่านการฆ่าเชื้อ และตรวจสอบการมีอยู่ของระยะ L2, L3 และ L4 การมีอยู่ของระยะ L3 และ L4 บ่งชี้ถึงการเปลี่ยนแปลงของตัวอ่อน ในขณะที่การมีอยู่ของระยะ L2 บ่งชี้ว่าไม่มีการเปลี่ยนแปลง ภาพได้รับโดยใช้ระบบสร้างภาพเซลล์ดิจิทัล iRiS™ การทดลองนี้ดำเนินการเป็นสองขั้นตอน โดยแต่ละขั้นตอนมีการทำซ้ำหกครั้ง ข้อมูลจากทั้งสองการทดลองได้รับการรวมและนำเสนอ
ความเป็นพิษของ 5-ไอโอโดอินโดลและอาเวอร์เมกตินต่อเมล็ดพืชได้รับการประเมินโดยใช้การทดสอบการงอกบนแผ่นวุ้น Murashige และ Skoog62 แช่เมล็ดพันธุ์ B. oleracea และ R. raphanistrum ในน้ำกลั่นที่ผ่านการฆ่าเชื้อเป็นเวลา 1 วันก่อน จากนั้นล้างด้วยเอธานอล 100% 1 มิลลิลิตร ฆ่าเชื้อด้วยสารฟอกขาวเชิงพาณิชย์ 50% 1 มิลลิลิตร (โซเดียมไฮโปคลอไรต์ 3%) เป็นเวลา 15 นาที แล้วล้างด้วยน้ำที่ผ่านการฆ่าเชื้อ 1 มิลลิลิตร 5 ครั้ง จากนั้นกดเมล็ดพันธุ์ที่ผ่านการฆ่าเชื้อลงบนแผ่นวุ้นการงอกที่มีอาหารเลี้ยงเชื้อ Murashige และ Skoog 0.86 กรัม/ลิตร (0.2 เท่า) และวุ้นแบคทีเรีย 0.7% ร่วมกับหรือไม่มี 5-ไอโอโดอินโดลหรืออาเวอร์เมกติน จากนั้นฟักแผ่นวุ้นที่อุณหภูมิ 22 องศาเซลเซียส และถ่ายภาพหลังจากฟักเป็นเวลา 3 วัน การทดลองนี้ดำเนินการเป็น 2 ขั้นตอน โดยแต่ละขั้นตอนมีการทำซ้ำ 6 ครั้ง