ขอขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature.comเวอร์ชันของเบราว์เซอร์ที่คุณใช้มีการรองรับ CSS อย่างจำกัดเพื่อผลลัพธ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์เวอร์ชันใหม่กว่า (หรือปิดใช้งานโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer)ในระหว่างนี้ เพื่อให้มั่นใจว่าได้รับการสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เรากำลังแสดงเว็บไซต์ที่ไม่มีรูปแบบหรือ JavaScript
การค้นพบและการใช้ผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติให้เกิดประโยชน์สามารถช่วยปรับปรุงชีวิตมนุษย์ได้สารเคมียับยั้งการเจริญเติบโตของพืชถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายเป็นสารกำจัดวัชพืชเพื่อควบคุมวัชพืชเนื่องจากจำเป็นต้องใช้สารกำจัดวัชพืชประเภทต่างๆ จึงจำเป็นต้องระบุสารประกอบที่มีกลไกการออกฤทธิ์ใหม่ในการศึกษานี้ เราค้นพบสารประกอบ N -alkoxypyrrole ชนิดใหม่ คูมาโมนาไมด์ จาก Streptomyces werraensis MK493-CF1 และสร้างกระบวนการสังเคราะห์ที่สมบูรณ์จากการตรวจสอบฤทธิ์ทางชีวภาพ เราค้นพบว่ากรด urs-monoamic เป็นตัวกลางสังเคราะห์ของ urs-monoamide และมีศักยภาพสารยับยั้งการเจริญเติบโตของพืช-นอกจากนี้ เราได้พัฒนาอนุพันธ์ของกรดเออร์เบโนนิกหลายชนิด รวมถึงอนุพันธ์ของเออร์เบนิลออกซี (UDA) ซึ่งมีฤทธิ์กำจัดวัชพืชสูงโดยไม่ส่งผลเสียต่อการเจริญเติบโตของเซลล์ HeLaนอกจากนี้เรายังพบว่าอนุพันธ์ของกรดเออร์โมโตนิกรบกวนไมโครทูบูลของพืชนอกจากนี้ KAND ยังส่งผลต่อเส้นใยแอกตินและทำให้เซลล์ตายผลกระทบหลายแง่มุมเหล่านี้แตกต่างจากสารยับยั้งไมโครทูบูลที่รู้จัก และแนะนำกลไกการออกฤทธิ์ใหม่สำหรับกรดเออร์โซนิก ซึ่งแสดงถึงข้อได้เปรียบที่สำคัญในการพัฒนาสารกำจัดวัชพืชชนิดใหม่
การค้นพบและการประยุกต์ใช้ผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติที่เป็นประโยชน์และอนุพันธ์ของผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติเป็นวิธีการปรับปรุงคุณภาพชีวิตของมนุษย์สารทุติยภูมิที่เกิดจากจุลินทรีย์ พืช และแมลงได้นำไปสู่ความก้าวหน้าครั้งสำคัญในด้านการแพทย์และการเกษตรยาปฏิชีวนะและยาต้านมะเร็งเม็ดเลือดขาวหลายชนิดได้รับการพัฒนาจากผลิตภัณฑ์จากธรรมชาตินอกจากนี้ประเภทต่างๆยาฆ่าแมลงสารฆ่าเชื้อราและสารกำจัดวัชพืชสกัดจากผลิตภัณฑ์ธรรมชาติเหล่านี้เพื่อใช้ในการเกษตรโดยเฉพาะอย่างยิ่ง สารกำจัดวัชพืชควบคุมวัชพืชเป็นเครื่องมือสำคัญในการเพิ่มผลผลิตพืชผลในการเกษตรสมัยใหม่ และสารประกอบหลายประเภทก็ถูกนำมาใช้ในเชิงพาณิชย์อยู่แล้วกระบวนการเซลล์หลายอย่างในพืช เช่น การสังเคราะห์ด้วยแสง เมแทบอลิซึมของกรดอะมิโน การสังเคราะห์ผนังเซลล์ การควบคุมการแบ่งเซลล์ การส่งสัญญาณไฟโตฮอร์โมน หรือการสังเคราะห์โปรตีน ถือเป็นเป้าหมายทั่วไปของสารกำจัดวัชพืชสารประกอบที่ยับยั้งการทำงานของไมโครทูบูลนั้นเป็นสารกำจัดวัชพืชประเภทหนึ่งทั่วไปที่ส่งผลต่อการเจริญเติบโตของพืชโดยส่งผลต่อการควบคุมไมโทติค2
Microtubules เป็นส่วนประกอบของโครงร่างโครงกระดูกและได้รับการอนุรักษ์อย่างกว้างขวางในเซลล์ยูคาริโอตเฮเทอโรไดเมอร์ของทูบูลินประกอบด้วย α-tubulin และ β-tubulin ซึ่งสร้างโปรโตฟิลาเมนต์ไมโครทูบูลเชิงเส้น โดยมีโปรโตฟิลาเมนต์ 13 ตัวสร้างโครงสร้างทรงกระบอกไมโครทูบูลมีบทบาทหลายอย่างในเซลล์พืช รวมถึงการกำหนดรูปร่างของเซลล์ การแบ่งเซลล์ และการขนส่งภายในเซลล์3,4เซลล์พืชประกอบด้วยไมโครทูบูลใต้เยื่อหุ้มพลาสมาระหว่างเฟส และเชื่อว่าไมโครทูบูลในเยื่อหุ้มสมองเหล่านี้ควบคุมการจัดระเบียบของไมโครไฟบริลเซลลูโลสผ่านการควบคุมของคอมเพล็กซ์เซลลูโลสซินเทส4,5ไมโครทูบูลในเยื่อหุ้มสมองของเซลล์ผิวหนังชั้นนอกของราก ซึ่งอยู่ในบริเวณที่มีการยืดตัวอย่างรวดเร็วของปลายราก จะตั้งอยู่ด้านข้าง และไมโครทูบูลเซลลูโลสจะติดตามไมโครทูบูลเหล่านี้และจำกัดทิศทางของการขยายตัวของเซลล์ ดังนั้น จึงส่งเสริมการยืดตัวของเซลล์แบบแอนไอโซทรอปิกดังนั้นการทำงานของไมโครทูบูลจึงสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับสัณฐานวิทยาของพืชการทดแทนกรดอะมิโนในยีนที่เข้ารหัส tubulin ทำให้เกิดการเอียงของอาร์เรย์ microtubule ในเยื่อหุ้มสมองและการเจริญเติบโตด้านซ้ายหรือด้านขวาใน Arabidopsis 6,7ในทำนองเดียวกันการกลายพันธุ์ในโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ microtubule ซึ่งควบคุมการเปลี่ยนแปลงของ microtubule ยังสามารถนำไปสู่การเจริญเติบโตของรากที่บิดเบี้ยว 8,9,10,11,12,13นอกจากนี้ การรักษาด้วยสารกำจัดวัชพืชที่รบกวนไมโครทิวบูล เช่น ไดโซปิราไมด์ หรือที่รู้จักในชื่อเพรติลาคลอร์ ก็ทำให้รากเฉียงด้านซ้ายเจริญเติบโตเช่นกันข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่าการควบคุมการทำงานของไมโครทูบูลที่แม่นยำเป็นสิ่งสำคัญในการกำหนดทิศทางการเจริญเติบโตของพืช
มีการค้นพบสารยับยั้งไมโครทูบูลประเภทต่างๆ และยาเหล่านี้มีส่วนสำคัญต่อการวิจัยโครงร่างโครงร่างเซลล์ เช่นเดียวกับการเกษตรและการแพทย์2โดยเฉพาะอย่างยิ่ง oryzalin, สารประกอบ dinitroaniline, disopyramide, สารประกอบที่เกี่ยวข้องกับเบนซาไมด์ และสารอะนาล็อกของพวกมันสามารถยับยั้งการทำงานของไมโครทูบูลและด้วยเหตุนี้จึงยับยั้งการเจริญเติบโตของพืชดังนั้นจึงมีการใช้กันอย่างแพร่หลายเป็นสารกำจัดวัชพืชอย่างไรก็ตาม เนื่องจากไมโครทูบูลเป็นส่วนประกอบที่สำคัญของเซลล์พืชและสัตว์ สารยับยั้งไมโครทูบูลส่วนใหญ่จึงเป็นพิษต่อเซลล์ทั้งสองประเภทดังนั้น ถึงแม้จะได้รับการยอมรับว่าเป็นสารกำจัดวัชพืช แต่ก็มีการใช้สารต้านจุลชีพจำนวนจำกัดเพื่อวัตถุประสงค์ในทางปฏิบัติ
Streptomyces เป็นสกุลหนึ่งของตระกูล Streptomyces ซึ่งรวมถึงแบคทีเรียแอโรบิก แกรมบวก และเส้นใย และเป็นที่รู้จักอย่างกว้างขวางถึงความสามารถในการผลิตสารทุติยภูมิที่หลากหลายดังนั้นจึงถือว่าเป็นหนึ่งในแหล่งที่สำคัญที่สุดของผลิตภัณฑ์ธรรมชาติที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพชนิดใหม่ในการศึกษาปัจจุบัน เราค้นพบสารประกอบใหม่ที่เรียกว่าคูมาโมนาไมด์ ซึ่งแยกได้จาก Streptomyces werraensis MK493-CF1 และ S. werraensis ISP 5486 การใช้การวิเคราะห์สเปกตรัมและการวิเคราะห์สเปกตรัมแบบเต็ม ทำให้โครงสร้างของคูมาโมนาไมด์มีลักษณะเฉพาะและโครงกระดูก N-alkoxypyrrole อันเป็นเอกลักษณ์ของมัน ถูกกำหนดแล้วสังเคราะห์.พบว่ากรดเออร์สโมนิกซึ่งเป็นสารตัวกลางสังเคราะห์ของเออร์สโมโนเอไมด์และอนุพันธ์ของกรดเออร์สโมนิกสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตและการงอกของพืชต้นแบบยอดนิยมอย่าง Arabidopsis thalianaในการศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างและกิจกรรม เราพบว่าสารประกอบที่มี C9 ที่ถูกดัดแปลงเป็นกรดเออร์โซนิก เรียกว่าอนุพันธ์โนนิลออกซีของกรดเออร์โซนิก (KAND) ช่วยเพิ่มผลการยับยั้งการเจริญเติบโตและการงอกอย่างมีนัยสำคัญสารยับยั้งการเจริญเติบโตของพืชที่เพิ่งค้นพบยังส่งผลต่อการเจริญเติบโตของยาสูบและสาโทตับ และไม่เป็นพิษต่อแบคทีเรียหรือเซลล์ HeLaนอกจากนี้อนุพันธ์ของกรดเออร์โมโตนิกบางชนิดยังกระตุ้นให้เกิดฟีโนไทป์ของรากที่บิดเบี้ยว ซึ่งหมายความว่าอนุพันธ์เหล่านี้ส่งผลโดยตรงหรือโดยอ้อมต่อไมโครทูบูลสอดคล้องกับแนวคิดนี้ การสังเกตของเราเกี่ยวกับ microtubules ที่มีป้ายกำกับว่าอิมมูโนฮิสโตเคมีหรือโปรตีนเรืองแสงบ่งชี้ว่าการรักษา KAND จะทำให้ไมโครทูบูลสลายตัวนอกจากนี้ การบำบัดด้วยอนุพันธ์ของกรดคุมะโมโตนิกจะรบกวนไมโครฟิลาเมนต์ของแอกตินดังนั้นเราจึงได้ค้นพบสารยับยั้งการเจริญเติบโตของพืชชนิดใหม่ซึ่งมีกลไกการออกฤทธิ์เฉพาะที่เกี่ยวข้องกับการทำลายโครงร่างโครงร่าง
สายพันธุ์ MK493-CF1 ถูกแยกได้จากดินในเขตชินากาวะ โตเกียวสายพันธุ์ MK493-CF1 ก่อรูปสโตรมัลไมซีเลียมที่มีกิ่งก้านอย่างดีลำดับบางส่วนของยีน 16S ribosomal RNA (1422 bp) ถูกกำหนดไว้สายพันธุ์นี้คล้ายกับ S. werraensis มาก (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: สายพันธุ์ทั่วไป, 99.93%)จากผลลัพธ์นี้ พบว่าสายพันธุ์นี้มีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับสายพันธุ์ชนิดของ S. werraensisดังนั้นเราจึงตั้งชื่อสายพันธุ์นี้ชั่วคราวว่า S. werraensis MK493-CF1S. werraensis ISP 5486T ยังผลิตสารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพเช่นเดียวกันเนื่องจากมีการวิจัยเพียงเล็กน้อยในการได้รับผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติจากจุลินทรีย์นี้ จึงได้มีการวิจัยทางเคมีเพิ่มเติมหลังจากการเพาะเลี้ยง S. werraensis MK493-CF1 บนอาหารเลี้ยงข้าวบาร์เลย์โดยการหมักแบบโซลิดสเตตที่อุณหภูมิ 30°C เป็นเวลา 14 วัน อาหารเลี้ยงเชื้อจะถูกสกัดด้วย EtOH 50%ตัวอย่าง 60 มิลลิลิตรถูกทำให้แห้งเพื่อให้ได้สารสกัดที่หยาบ 59.5 มิลลิกรัมสารสกัดที่ยังไม่ผ่านกระบวนการใดๆ ถูกนำไปยัง HPLC แบบรีเวอร์สเฟสเพื่อให้ N-เมทอกซี-1H-ไพโรล-2-คาร์บอกซาไมด์ (1, ชื่อคูมาโมนาไมด์, 36.0 มก.)จำนวนรวม 1 เท่ากับประมาณ 60% ของสารสกัดหยาบดังนั้นเราจึงตัดสินใจศึกษารายละเอียดคุณสมบัติของ kumamotoamide 1
Coumamonamide 1 เป็นผงอสัณฐานสีขาวและมีแมสสเปกโตรเมทรีความละเอียดสูง (HRESIMS) ยืนยัน C6H8N2O2 (รูปที่ 1)ชิ้นส่วนไพร์โรลที่แทนที่ C2 ของสารประกอบนี้มีลักษณะเฉพาะคือ δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH ในสเปกตรัม 1H NMR: 4.5 Hz , H-5) และ δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) และสเปกตรัม 13C NMR แสดงการมีอยู่ของอะตอมคาร์บอน sp2 สี่อะตอมการมีอยู่ของกลุ่มเอไมด์ที่ตำแหน่ง C2 ได้รับการประเมินโดยความสัมพันธ์ของ HMBC จากโปรตอน C-3 กับเอไมด์คาร์บอนิลคาร์บอนที่ δC 161.1นอกจากนี้ 1 H และ 13 C NMR พีคที่ δH 4.10 (3H, S) และ δC 68.3 บ่งชี้ถึงการมีอยู่ของกลุ่ม N-methoxy ในโมเลกุลแม้ว่าตำแหน่งที่ถูกต้องของหมู่เมทอกซีจะยังไม่ได้รับการพิจารณาโดยใช้การวิเคราะห์ทางสเปกโทรสโกปี เช่น สเปกโทรสโกปีที่แตกต่างที่เพิ่มขึ้นและตัวย่อ Overhauser นิวเคลียร์ (NOEDF) แต่ N-เมทอกซี-1H-ไพร์โรล-2-คาร์บอกซาไมด์ก็กลายเป็นสารประกอบตัวเลือกแรก
เพื่อกำหนดโครงสร้างที่ถูกต้องของ 1 จึงทำการสังเคราะห์ทั้งหมด (รูปที่ 2a)การบำบัด 2-อะมิโนไพริดีน 2 ที่มีวางจำหน่ายทั่วไปด้วย m-CPBA ส่งผลให้เกิด N-ออกไซด์ 3 ที่สอดคล้องกันในผลผลิตเชิงปริมาณหลังจากการทำ 2-อะมิโนอะมิโนอะซิเดชันของ 2 ปฏิกิริยาไซโคลคอนเดนเซชันที่อธิบายโดยอับราโมวิชถูกดำเนินการในเบนซีนที่อุณหภูมิ 90°C เพื่อให้ได้ 1-ไฮดรอกซี-1H-ไพโรล-2-คาร์โบไนไทรล์ 5 เป็นกรัมที่ต้องการความเร็ว 60% (สองขั้นตอน)15,16.จากนั้นเมทิลเลชันและไฮโดรไลซิสของ 4 ก็ได้ให้กรด 1-เมทอกซี-1H-ไพโรล-2-คาร์บอกซิลิก (เรียกว่า "กรดคิวโมโทนิก", 6) ให้ผลผลิตที่ดี (70%, สองขั้นตอน)ในที่สุด อะไมด์ผ่านกรดคลอไรด์สารมัธยันตร์ 6 โดยใช้แอมโมเนียในน้ำทำให้คุมาโมโตะเอไมด์ 1 ได้ผลผลิต 98%ข้อมูลสเปกตรัมทั้งหมดของ 1 สังเคราะห์ได้คล้ายกับที่แยกได้ 1 ดังนั้นจึงกำหนดโครงสร้างของ 1
การสังเคราะห์และการวิเคราะห์ทั่วไปของฤทธิ์ทางชีวภาพของเออร์เบนาไมด์และกรดเออร์เบนิก(a) การสังเคราะห์ทั้งหมดของเอไมด์คุมาโมโตะ( b ) ต้นกล้า Arabidopsis Columbia (Col) ประเภทป่าอายุเจ็ดวันปลูกบนจาน Murashige และ Skoog (MS) ที่มี coumamonamide 6 หรือ coumamonamide 1 ที่ความเข้มข้นที่ระบุสเกลบาร์ = 1 ซม.
อันดับแรก เราประเมินกิจกรรมทางชีวภาพของเออร์เบนาไมด์และสารตัวกลางสำหรับความสามารถในการปรับการเจริญเติบโตของพืชเราเพิ่มความเข้มข้นต่างๆ ของ ursmonamide 1 หรือ ursmonic acid 6 ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ MS และต้นกล้า Arabidopsis thaliana ที่เพาะเลี้ยงบนอาหารเลี้ยงเชื้อนี้การทดสอบเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าความเข้มข้นสูง (500 μM) ของ 6 ยับยั้งการเจริญเติบโตของราก (รูปที่ 2b)ต่อไป เราสร้างอนุพันธ์ต่างๆ โดยการแทนที่ตำแหน่ง N1 ของ 6 และดำเนินการศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างและกิจกรรมกับอนุพันธ์เหล่านั้น (กระบวนการสังเคราะห์แบบอะนาล็อกอธิบายไว้ในข้อมูลสนับสนุน (SI))ต้นกล้า Arabidopsis ปลูกบนอาหารที่มีอนุพันธ์ของกรดเออร์โซนิก 50 μM และวัดความยาวของรากตามที่แสดงในภาพดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 3a, b และ S1 กรดคูมาโมมีความยาวต่างกันของสายโซ่อัลคอกซีเชิงเส้น (9, 10, 11, 12 และ 13) หรือสายโซ่อัลคอกซีขนาดใหญ่ (15, 16 และ 17) ที่ตำแหน่ง N1อนุพันธ์มีฤทธิ์ยับยั้งการเจริญเติบโตของรากได้อย่างมีนัยสำคัญนอกจากนี้ เราพบว่าการใช้ 200 μM 10, 11 หรือ 17 ยับยั้งการงอก (รูปที่ 3c และ S2)
ศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างและกิจกรรมของเอไมด์คุมาโมโตะและสารประกอบที่เกี่ยวข้อง(ก) โครงสร้างและการสังเคราะห์อะนาลอก(b) ปริมาณความยาวรากของต้นกล้าอายุ 7 วันที่ปลูกบนอาหาร MS โดยมีหรือไม่มีอนุพันธ์ของคูมาโมนาไมด์ 50 μMเครื่องหมายดอกจันบ่งบอกถึงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญกับการรักษาแบบหลอกลวง (t test, p< 0.05)น>18. ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SDnt แปลว่า ไม่ได้ทดสอบ เพราะเมล็ดพืชมากกว่า 50% ไม่งอก(c) ปริมาณอัตราการงอกของเมล็ดที่ผ่านการบ่มเป็นเวลา 7 วันในอาหารเลี้ยงเชื้อ MS โดยมีหรือไม่มีคูมาโมนาไมด์ 200 μM และสารประกอบที่เกี่ยวข้องเครื่องหมายดอกจันบ่งบอกถึงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญกับการรักษาแบบหลอกลวง (การทดสอบไคสแควร์)n=96.
สิ่งที่น่าสนใจคือการเพิ่มโซ่ข้างอัลคิลที่ยาวกว่า C9 ช่วยลดฤทธิ์ยับยั้ง แสดงให้เห็นว่าสารประกอบที่เกี่ยวข้องกับกรดคุมาโมโตอิกต้องใช้โซ่ข้างขนาดที่กำหนดเพื่อแสดงฤทธิ์ทางชีวภาพของพวกมัน
เนื่องจากการวิเคราะห์ความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างและกิจกรรมแสดงให้เห็นว่า C9 ได้รับการดัดแปลงเป็นกรด ursonic และอนุพันธ์ nonyloxy ของกรด ursonic (ต่อไปนี้จะเรียกว่า KAND 11) เป็นตัวยับยั้งการเจริญเติบโตของพืชที่มีประสิทธิภาพมากที่สุด เราจึงทำการศึกษาลักษณะเฉพาะของ KAND 11 ที่มีรายละเอียดมากขึ้น ด้วย 50 μM KAND 11 ป้องกันการงอกได้เกือบทั้งหมด ในขณะที่ความเข้มข้นที่ต่ำกว่า (40, 30, 20 หรือ 10 μM) ของ KAND 11 ยับยั้งการเจริญเติบโตของรากในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา (รูปที่ 4a, b)เพื่อทดสอบว่า KAND 11 ส่งผลกระทบต่อความมีชีวิตของเนื้อเยื่อรากหรือไม่ เราได้ตรวจสอบเนื้อเยื่อของรากที่ย้อมด้วยโพรพิเดียมไอโอไดด์ (PI) และวัดขนาดพื้นที่ของเนื้อเยื่อเนื้อเยื่อขนาดของเนื้อเยื่อของต้นกล้าที่ปลูกบนอาหารที่มี 25 μM KAND-11 คือ 151.1 ± 32.5 μm ในขณะที่ขนาดของเนื้อเยื่อของต้นกล้าที่ปลูกบนอาหารควบคุมที่มี DMSO คือ 264.7 ± 30.8 μm (รูปที่ 4c, d) ซึ่งบ่งชี้ว่า KAND-11 ฟื้นฟูกิจกรรมของเซลล์การแพร่กระจาย.เนื้อเยื่อรากสอดคล้องกับสิ่งนี้ การรักษา KAND 11 ช่วยลดจำนวนเครื่องหมายการแบ่งเซลล์ CDKB2; 1p :: CDKB2; 1-GUS สัญญาณในเนื้อเยื่อราก (รูปที่ 4e) 17ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า KAND 11 ยับยั้งการเจริญเติบโตของรากโดยการลดกิจกรรมการเพิ่มจำนวนเซลล์
การวิเคราะห์ผลการยับยั้งอนุพันธ์ของกรดเออร์เบโนนิก (อนุพันธ์ของเออร์เบนิลออกซี) ต่อการเจริญเติบโต( a ) ต้นกล้า Col ชนิดป่าอายุ 7 วันที่ปลูกบนจาน MS โดยมีความเข้มข้นที่ระบุของ KAND 11 สเกลบาร์ = 1 ซม.(b) ปริมาณความยาวรากตัวอักษรบ่งบอกถึงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญ (การทดสอบ Tukey HSD, p< 0.05)น>16. ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SD( c ) กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลของราก Col ชนิดป่าที่ย้อมด้วยโพรพิเดียมไอโอไดด์ที่ปลูกบนเพลต MS โดยมีหรือไม่มี 25 μM KAND 11 วงเล็บสีขาวบ่งบอกถึงเนื้อเยื่อของรากสเกลบาร์ = 100 µm(d) ปริมาณของขนาดเนื้อเยื่อราก (n = 10 ถึง 11)ความแตกต่างทางสถิติถูกกำหนดโดยใช้การทดสอบที (หน้า< 0.05)แท่งแสดงถึงขนาดเนื้อเยื่อโดยเฉลี่ย(e) กล้องจุลทรรศน์ดิฟเฟอเรนเชียลอินเทอร์เทอร์เชียลคอนทราสต์ (DIC) ของเนื้อเยื่อรากที่มีโครงสร้าง CDKB21pro: CDKB2;1-GUS ย้อมและย้อมบนต้นกล้าอายุ 5 วันที่ปลูกบนจาน MS โดยมีหรือไม่มีการทดสอบ KAND 25 µM
ความเป็นพิษต่อพืชของ KAND 11 ได้รับการทดสอบเพิ่มเติมโดยใช้พืชใบเลี้ยงคู่อีกชนิดหนึ่ง ยาสูบ (Nicotiana tabacum) และสิ่งมีชีวิตต้นแบบของพืชบกที่สำคัญ คือ ลิเวอร์เวิร์ต (Marchantia polymorpha)เช่นเดียวกับในกรณีของ Arabidopsis ต้นกล้ายาสูบ SR-1 ที่ปลูกบนอาหารที่มี 25 μM KAND 11 จะสร้างรากที่สั้นกว่า (รูปที่ 5a)นอกจากนี้ เมล็ด 40 จาก 48 เมล็ดงอกบนจานที่มี 200 μM KAND 11 ในขณะที่เมล็ดทั้ง 48 เมล็ดงอกบนอาหารเลี้ยงเชื้อจำลอง ซึ่งบ่งชี้ว่าความเข้มข้นของ KAND ที่สูงขึ้นนั้นมีนัยสำคัญ (p<0.05;ไคทดสอบ -สแควร์) ยับยั้งการงอกของยาสูบ(รูปที่ 5b)นอกจากนี้ความเข้มข้นของ KAND 11 ที่ยับยั้งการเจริญเติบโตของแบคทีเรียในตับมีความคล้ายคลึงกับความเข้มข้นที่มีประสิทธิผลใน Arabidopsis (รูปที่ 5c)ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า KAND 11 สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของพืชได้หลากหลายชนิดจากนั้นเราตรวจสอบความเป็นพิษที่เป็นไปได้ของสารประกอบที่เกี่ยวข้องกับหมีโมโนเอไมด์ในสิ่งมีชีวิตอื่น ได้แก่ เซลล์ HeLa ของมนุษย์ และ Escherichia coli สายพันธุ์ DH5α ซึ่งเป็นตัวแทนของเซลล์สัตว์และแบคทีเรียที่สูงขึ้นตามลำดับในชุดการทดสอบการเพิ่มจำนวนเซลล์ เราสังเกตว่า coumamonamide 1, coumamonamidic acid 6 และ KAND 11 ไม่ส่งผลต่อการเจริญเติบโตของเซลล์ HeLa หรือ E. coli ที่ความเข้มข้น 100 μM (รูปที่ 5d,e)
การยับยั้งการเจริญเติบโตของ KAND 11 ในสิ่งมีชีวิตที่ไม่ใช่ Arabidopsis( a ) ต้นกล้ายาสูบ SR-1 ประเภทป่าอายุสองสัปดาห์ถูกปลูกบนแผ่น MS ในแนวตั้งที่มี 25 μM KAND 11 ( b ) ต้นกล้ายาสูบ SR-1 ประเภทป่าอายุสองสัปดาห์ถูกปลูกในแนวนอน เพลต MS ที่มี 200 μM KAND 11 ( c ) ตาตับตับ Tak-1 ชนิดป่าอายุสองสัปดาห์ที่ปลูกบนเพลต Gamborg B5 โดยมีความเข้มข้นที่ระบุของ KAND 11 ลูกศรสีแดงบ่งบอกถึงสปอร์ที่หยุดการเจริญเติบโตภายในการฟักตัวสองสัปดาห์ ระยะเวลา.(d) การทดสอบการเพิ่มจำนวนเซลล์ของเซลล์ HeLaจำนวนเซลล์ที่มีชีวิตถูกวัดที่ช่วงเวลาที่คงที่โดยใช้ชุดการนับเซลล์ 8 (โดจินโด)เพื่อเป็นการควบคุม เซลล์ HeLa ได้รับการบำบัดด้วยแอคติโนมัยซิน D 5 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร (Act D) ซึ่งยับยั้งการถอดรหัส RNA โพลีเมอเรสและทำให้เซลล์ตายการวิเคราะห์ดำเนินการเป็นสามเท่า(e) การสอบวิเคราะห์การเพิ่มจำนวนเซลล์ E. coliการเจริญเติบโตของ อี. โคไล ถูกวิเคราะห์โดยการวัด OD600เพื่อเป็นการควบคุม เซลล์ได้รับการบำบัดด้วยแอมพิซิลลิน (Amp) 50 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ซึ่งยับยั้งการสังเคราะห์ผนังเซลล์ของแบคทีเรียการวิเคราะห์ดำเนินการเป็นสามเท่า
เพื่อถอดรหัสกลไกการออกฤทธิ์ของความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เกิดจากสารประกอบที่เกี่ยวข้องกับยูราไมด์ เราได้วิเคราะห์อนุพันธ์ของกรดเออร์เบนิกใหม่ซึ่งมีฤทธิ์ยับยั้งในระดับปานกลางตามที่แสดงในภาพดังที่แสดงในรูปที่ 2b, 6a ต้นกล้าที่ปลูกบนจานวุ้นที่มีกรดเออร์โมโทนิก 6 ที่มีความเข้มข้นสูง (200 μM) จะสร้างรากที่สั้นกว่าและโค้งซ้าย (θ = – 23.7 ± 6.1) ในขณะที่ต้นกล้าที่ปลูกบนสื่อควบคุม ต้นกล้ามีรากเกือบตรง (θ = – 3.8 ± 7.1)การเจริญเติบโตแบบเฉียงลักษณะนี้เป็นที่รู้กันว่าเป็นผลมาจากความผิดปกติของ microtubules ในเยื่อหุ้มสมอง14,18สอดคล้องกับการค้นพบนี้ ยา disopyramide และ oryzalin ที่ทำให้ microtubule ทำให้เกิดความคงตัวทำให้เกิดการเอียงของรากที่คล้ายกันภายใต้สภาพการเจริญเติบโตของเรา (รูปที่ 2b, 6a)ในเวลาเดียวกัน เราได้ทดสอบอนุพันธ์ของกรดเออร์โมโทนิกและเลือกหลายตัวที่ทำให้เกิดการเจริญเติบโตของรากเฉียงที่ความเข้มข้นที่กำหนดสารประกอบ 8, 9 และ 15 เปลี่ยนทิศทางการเจริญเติบโตของรากที่ 75 μM, 50 μM และ 40 μM ตามลำดับ ซึ่งบ่งชี้ว่าสารประกอบเหล่านี้สามารถทำให้ microtubules ไม่เสถียรได้อย่างมีประสิทธิภาพ (รูปที่ 2b, 6a)นอกจากนี้เรายังทดสอบอนุพันธ์ของกรดเออร์โซลิกที่มีศักยภาพมากที่สุดคือ KAND 11 ที่ความเข้มข้นต่ำกว่า (15 µM) และพบว่าการใช้ KAND 11 ยับยั้งการเจริญเติบโตของราก และทิศทางของการเจริญเติบโตของรากไม่เท่ากัน แม้ว่าพวกมันมีแนวโน้มที่จะเอียงไปทางซ้าย ( รูปที่ C3)-เนื่องจากความเข้มข้นที่สูงขึ้นของยาที่ทำให้ไม่เสถียรของ microtubule บางครั้งยับยั้งการเจริญเติบโตของพืชมากกว่าทำให้เกิดการเอียงของราก เราจึงประเมินความเป็นไปได้ที่ KAND 11 จะส่งผลกระทบต่อ microtubules โดยการสังเกต microtubules ในเยื่อหุ้มสมองในเซลล์ผิวหนังชั้นนอกของรากอิมมูโนฮิสโตเคมีโดยใช้แอนติบอดีต่อต้าน β-tubulin ในเซลล์ผิวหนังชั้นนอกของรากต้นกล้าที่รักษาด้วย 25 μM KAND 11 แสดงให้เห็นว่าการหายตัวไปของ microtubules ในเยื่อหุ้มสมองเกือบทั้งหมดในเซลล์ผิวหนังชั้นนอกในเขตการยืดตัว (รูปที่ 6b)ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่ากรดคุมะโมโตนิกและอนุพันธ์ของกรดทำหน้าที่โดยตรงหรือโดยอ้อมต่อไมโครทูบูลเพื่อรบกวนพวกมัน และสารประกอบเหล่านี้เป็นสารยับยั้งไมโครทูบูลชนิดใหม่
กรด Ursonic และอนุพันธ์ของกรดจะเปลี่ยน microtubules ในเยื่อหุ้มสมองใน Arabidopsis thaliana(a) มุมเอียงของรากที่วัดเมื่อมีอนุพันธ์ของกรดเออร์โมโตนิกหลายชนิดที่ความเข้มข้นที่ระบุนอกจากนี้ยังมีการวิเคราะห์ผลกระทบของสารประกอบสองชนิดที่ทราบกันว่าสามารถยับยั้งไมโครทูบูลได้ ได้แก่ ไดโซไพราไมด์และโอรีซาลินสิ่งที่ใส่เข้าไปจะแสดงมาตรฐานที่ใช้ในการวัดมุมการเจริญเติบโตของรากเครื่องหมายดอกจันบ่งบอกถึงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญกับการรักษาแบบหลอกลวง (t test, p< 0.05)น>19. สเกลบาร์ = 1 ซม.(b) microtubules ในเยื่อหุ้มสมองในเซลล์ผิวหนังชั้นนอกในเขตการยืดตัวMicrotubules ในราก Arabidopsis Col ชนิดป่าที่ปลูกบนเพลต MS ที่มีหรือไม่มี 25 μM KAND 11 ถูกมองเห็นโดยการย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมีโดยใช้แอนติบอดีปฐมภูมิ tub-tubulin และแอนติบอดีรองที่ผันด้วย Alexa Fluorสเกลบาร์ = 10 µm(c) โครงสร้างไมโทติคของไมโครทูบูลในเนื้อเยื่อรากไมโครทูบูลถูกมองเห็นได้โดยใช้การย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมีโครงสร้างไมโทติค รวมถึงโซนพยากรณ์ สปินเดิล และแฟรกโมพลาสต์ ถูกนับจากภาพคอนโฟคอลลูกศรบ่งบอกถึงโครงสร้างไมโทติคไมโครทูบูลเครื่องหมายดอกจันบ่งบอกถึงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญกับการรักษาแบบหลอกลวง (t test, p< 0.05)น>9. สเกลบาร์ = 50 µm
แม้ว่า Ursa จะมีความสามารถในการขัดขวางการทำงานของ microtubule แต่กลไกการออกฤทธิ์ของมันคาดว่าจะแตกต่างจากสารลดการเกิดพอลิเมอร์ของ microtubule ทั่วไปตัวอย่างเช่น ความเข้มข้นที่สูงขึ้นของสารดีพอลิเมอไรเซชันของไมโครทูบูล เช่น ไดโซไพราไมด์และโอรีซาลิน ทำให้เกิดการขยายตัวแบบแอนไอโซโทรปิกของเซลล์ผิวหนังชั้นนอก ในขณะที่ KAND 11 ไม่เป็นเช่นนั้นนอกจากนี้การใช้ KAND 11 และ disopyramide ร่วมกันส่งผลให้เกิดการตอบสนองต่อการเจริญเติบโตของรากที่เกิดจาก disopyramide และการยับยั้งการเจริญเติบโตที่เกิดจาก KAND 11 (รูปที่ S4)นอกจากนี้เรายังวิเคราะห์การตอบสนองของการกลายพันธุ์ของ disopyramide 1-1 (phs1-1) ที่ไวต่อความรู้สึกต่อ KAND 11 phs1-1 มีการกลายพันธุ์ของจุด tubulin kinase ที่ไม่เป็นที่ยอมรับและสร้างรากที่สั้นลงเมื่อรับการรักษาด้วย disopyramide9,20ต้นกล้ากลายพันธุ์ phs1-1 ที่ปลูกบนอาหารวุ้นที่มี KAND 11 มีรากสั้นกว่าคล้ายกับที่ปลูกบนไดโซปิรามิด (รูปที่ S5)
นอกจากนี้เรายังสังเกตโครงสร้างของไมโทติคไมโครทูบูล เช่น โซนพยากรณ์ แกนหมุน และแฟรกโมพลาสต์ ในเนื้อเยื่อรากของต้นกล้าที่รักษาด้วย KAND 11 ซึ่งสอดคล้องกับการสังเกตสำหรับ CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS ซึ่งลดลงอย่างมีนัยสำคัญ สังเกตจำนวนไมโทติคไมโครทิวบูล (รูปที่ .6c)
เพื่อระบุลักษณะความเป็นพิษต่อเซลล์ของ KAND 11 ที่ความละเอียดระดับเซลล์ เราได้ทำการรักษาเซลล์แขวนลอยยาสูบ BY-2 ด้วย KAND 11 และสังเกตการตอบสนองของพวกเขาก่อนอื่นเราได้เพิ่มเซลล์ KAND 11 ลงในเซลล์ BY-2 ที่แสดง TagRFP-TUA6 ซึ่งติดป้ายกำกับ microtubules แบบเรืองแสงเพื่อประเมินผลกระทบของ KAND 11 ต่อ microtubules ในเยื่อหุ้มสมองประเมินความหนาแน่นของไมโครทูบูลในเยื่อหุ้มสมองโดยใช้การวิเคราะห์ภาพ ซึ่งวัดปริมาณเปอร์เซ็นต์ของพิกเซลไซโตสเกเลทัลในพิกเซลไซโตพลาสซึมผลการทดสอบพบว่าหลังการรักษาด้วย 50 μM หรือ 100 μM KAND 11 เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ความหนาแน่นลดลงอย่างมีนัยสำคัญเป็น 0.94 ± 0.74% หรือ 0.23 ± 0.28% ตามลำดับ ในขณะที่ความหนาแน่นของเซลล์ที่บำบัดด้วย DMSO มีค่าเท่ากับ 1.61 ± 0.34 % (รูปที่ 7a)ผลลัพธ์เหล่านี้สอดคล้องกับการสังเกตใน Arabidopsis ว่าการรักษา KAND 11 ทำให้เกิดการลดการเกิดโพลิเมอไรเซชันของ microtubules ในเยื่อหุ้มสมอง (รูปที่ 6b)นอกจากนี้เรายังตรวจสอบสาย BY-2 ด้วยเส้นใยแอกตินที่มีป้ายกำกับ GFP-ABD หลังการรักษาด้วยความเข้มข้นเท่ากันของ KAND 11 และสังเกตว่าการรักษา KAND 11 รบกวนเส้นใยแอกตินการรักษาด้วย 50 μM หรือ 100 μM KAND 11 เป็นเวลา 1 ชั่วโมงจะลดความหนาแน่นของเส้นใยแอคตินลงอย่างมีนัยสำคัญเป็น 1.20 ± 0.62% หรือ 0.61 ± 0.26% ตามลำดับ ในขณะที่ความหนาแน่นในเซลล์ที่ได้รับ DMSO อยู่ที่ 1.69 ± 0.51% (รูปที่ 2)7ข)ผลลัพธ์เหล่านี้ตรงกันข้ามกับผลกระทบของโพรพิซาไมด์ ซึ่งไม่ส่งผลกระทบต่อเส้นใยแอคติน และลาทรันคูลิน บี ซึ่งเป็นสารสลายโพลีเมอร์ของแอคตินที่ไม่ส่งผลกระทบต่อไมโครทูบูล (SI รูปที่ S6)นอกจากนี้ การรักษาด้วยคูมาโมนาไมด์ 1, กรดคูมาโมนาไมด์ 6 หรือ KAND 11 ไม่ส่งผลกระทบต่อไมโครทูบูลในเซลล์ HeLa (SI รูปที่ S7)ดังนั้นกลไกการออกฤทธิ์ของ KAND 11 จึงเชื่อกันว่าแตกต่างจากกลไกการออกฤทธิ์ของตัวทำลายโครงร่างโครงร่างที่รู้จักนอกจากนี้ การสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์ของเราของเซลล์ BY-2 ที่รักษาด้วย KAND 11 เผยให้เห็นการโจมตีของเซลล์ในระหว่างการรักษา KAND 11 และแสดงให้เห็นว่าสัดส่วนของเซลล์ที่ตายแล้วย้อมสีน้ำเงินของ Evans ไม่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังจาก 30 นาทีของการรักษา KAND 11 ในขณะที่ หลังจาก 90 นาทีของการรักษาด้วย 50 μM หรือ 100 μM KAND จำนวนเซลล์ที่ตายแล้วเพิ่มขึ้นเป็น 43.7% หรือ 80.1% ตามลำดับ (รูปที่ 7c)เมื่อนำมารวมกัน ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่าอนุพันธ์ของกรดเออร์โซลิกชนิดใหม่ KAND 11 เป็นตัวยับยั้งไซโตสเกเลทัลเฉพาะพืชซึ่งมีกลไกการออกฤทธิ์ที่ไม่รู้จักมาก่อน
KAND ส่งผลต่อไมโครทูบูลในเยื่อหุ้มสมอง เส้นใยแอกติน และความมีชีวิตของเซลล์ยาสูบ BY-2( a ) การแสดงภาพของ microtubules ในเยื่อหุ้มสมองในเซลล์ BY-2 ต่อหน้า TagRFP-TUA6ตรวจสอบเซลล์ BY-2 ที่รักษาด้วย KAND 11 (50 μM หรือ 100 μM) หรือ DMSO ด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลความหนาแน่นของ microtubule ในเยื่อหุ้มสมองคำนวณจากไมโครกราฟของเซลล์อิสระ 25 เซลล์ตัวอักษรบ่งบอกถึงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญ (การทดสอบ Tukey HSD, p< 0.05)สเกลบาร์ = 10 µm( b ) เส้นใยคอร์ติคอลแอคตินในเซลล์ BY-2 ที่มองเห็นเมื่อมี GFP-ABD2ตรวจสอบเซลล์ BY-2 ที่รักษาด้วย KAND 11 (50 μM หรือ 100 μM) หรือ DMSO ด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลความหนาแน่นของเส้นใยแอกตินในเยื่อหุ้มสมองคำนวณจากไมโครกราฟของเซลล์อิสระ 25 เซลล์ตัวอักษรบ่งบอกถึงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญ (การทดสอบ Tukey HSD, p< 0.05)สเกลบาร์ = 10 µm(c) การสังเกตเซลล์ BY-2 ที่ตายแล้วโดยการย้อมสีน้ำเงินของ Evansตรวจสอบเซลล์ BY-2 ที่รักษาด้วย KAND 11 (50 μM หรือ 100 μM) หรือ DMSO ด้วยกล้องจุลทรรศน์สนามสว่างn=3.สเกลบาร์ = 100 µm
การค้นพบและการประยุกต์ใช้ผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติใหม่ๆ ได้นำไปสู่ความก้าวหน้าที่สำคัญในด้านต่างๆ ของชีวิตมนุษย์ รวมถึงการแพทย์และการเกษตรมีการวิจัยทางประวัติศาสตร์เพื่อให้ได้สารประกอบที่มีประโยชน์จากทรัพยากรธรรมชาติโดยเฉพาะอย่างยิ่ง actinomycetes เป็นที่รู้กันว่ามีประโยชน์ในฐานะยาปฏิชีวนะต้านปรสิตสำหรับไส้เดือนฝอยเนื่องจากความสามารถในการผลิตสารทุติยภูมิต่างๆ เช่น avermectin ซึ่งเป็นสารประกอบตะกั่วของ ivermectin และ bleomycin และอนุพันธ์ของมัน ซึ่งใช้เป็นยาเป็นสารต้านมะเร็ง21,22ในทำนองเดียวกัน มีการค้นพบสารประกอบกำจัดวัชพืชหลายชนิดจากแอคติโนไมซีต ซึ่งบางส่วนได้นำไปใช้ในเชิงพาณิชย์แล้ว1,23ดังนั้นการวิเคราะห์สารแอคติโนไมซีตเพื่อแยกผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพที่ต้องการจึงถือเป็นกลยุทธ์ที่มีประสิทธิผลในการศึกษานี้ เราค้นพบสารประกอบใหม่ คูมาโมนาไมด์ จาก S. werraensis และสังเคราะห์ได้สำเร็จกรด Ursonic เป็นตัวกลางสังเคราะห์ของ urbenamide และอนุพันธ์ของมันมันสามารถทำให้เกิดการม้วนงอของรากที่มีลักษณะเฉพาะ มีฤทธิ์กำจัดวัชพืชในระดับปานกลางถึงรุนแรง และทำลายไมโครทิวบูลของพืชทั้งทางตรงและทางอ้อมอย่างไรก็ตาม กลไกการออกฤทธิ์ของกรดเออร์โมโทนิกอาจแตกต่างจากกลไกของสารยับยั้งไมโครทูบูลที่มีอยู่ เนื่องจาก KAND 11 ยังรบกวนเส้นใยแอกตินและทำให้เซลล์ตาย โดยเสนอแนะกลไกการควบคุมซึ่งกรดเออร์โมโทนิกและอนุพันธ์ของมันมีอิทธิพลต่อโครงสร้างเซลล์โครงร่างที่หลากหลาย-
การแสดงลักษณะเฉพาะของกรดเออร์เบโนนิกโดยละเอียดเพิ่มเติมจะช่วยให้เข้าใจกลไกการออกฤทธิ์ของกรดเออร์เบโนนิกได้ดีขึ้นโดยเฉพาะอย่างยิ่ง เป้าหมายต่อไปคือการประเมินความสามารถของกรดเออร์โซนิกในการจับกับไมโครทูบูลรีดิวซ์เพื่อตรวจสอบว่ากรดเออร์โซนิกและอนุพันธ์ของมันออกฤทธิ์โดยตรงกับไมโครทูบูลและทำให้โพลีเมอร์ไลซ์พวกมันหรือไม่ หรือการกระทำของพวกมันส่งผลให้เกิดความไม่เสถียรของไมโครทูบูลหรือไม่นอกจากนี้ ในกรณีที่ไมโครทูบูลไม่ใช่เป้าหมายโดยตรง การระบุตำแหน่งออกฤทธิ์และเป้าหมายระดับโมเลกุลของกรดเออร์โซนิกบนเซลล์พืชจะช่วยให้เข้าใจคุณสมบัติของสารประกอบที่เกี่ยวข้องมากขึ้น และวิธีการที่เป็นไปได้ในการปรับปรุงฤทธิ์กำจัดวัชพืชการทดสอบฤทธิ์ทางชีวภาพของเราเผยให้เห็นความสามารถเฉพาะตัวของกรดเออร์โซนิกต่อการเจริญเติบโตของพืช เช่น Arabidopsis thaliana ยาสูบ และสาโทตับ ในขณะที่ทั้งเซลล์ E. coli และ HeLa ไม่ได้รับผลกระทบความเป็นพิษเพียงเล็กน้อยหรือไม่มีเลยต่อเซลล์สัตว์ถือเป็นข้อได้เปรียบของอนุพันธ์ของกรดเออร์โซนิก หากได้รับการพัฒนาเป็นสารกำจัดวัชพืชสำหรับใช้ในทุ่งเกษตรแบบเปิดอันที่จริงเนื่องจากไมโครทูบูลเป็นโครงสร้างทั่วไปในยูคาริโอต การยับยั้งการคัดเลือกในพืชจึงเป็นข้อกำหนดสำคัญสำหรับสารกำจัดวัชพืชตัวอย่างเช่น โพรไพซาไมด์ซึ่งเป็นสารดีพอลิเมอร์แบบไมโครทูบูลที่จับกับทูบูลินโดยตรงและยับยั้งการเกิดพอลิเมอไรเซชัน ถูกใช้เป็นสารกำจัดวัชพืชเนื่องจากมีความเป็นพิษต่ำต่อเซลล์สัตว์24ตรงกันข้ามกับไดโซไพราไมด์ เบนซาไมด์ที่เกี่ยวข้องมีความจำเพาะต่อเป้าหมายที่แตกต่างกันนอกจากไมโครทูบูลของพืชแล้ว RH-4032 หรือเบนโซซาไมด์ยังยับยั้งไมโครทูบูลของเซลล์สัตว์หรือโอไมซีตตามลำดับ และซาลิลาไมด์ก็ถูกใช้เป็นยาฆ่าเชื้อราเนื่องจากมีความเป็นพิษต่อพืชต่ำ25,26,27หมีที่เพิ่งค้นพบและอนุพันธ์ของมันแสดงความเป็นพิษต่อเซลล์แบบเลือกสรรต่อพืช แต่เป็นที่น่าสังเกตว่าการปรับเปลี่ยนเพิ่มเติมอาจเปลี่ยนแปลงความจำเพาะของเป้าหมาย ซึ่งอาจให้อนุพันธ์เพิ่มเติมสำหรับการควบคุมเชื้อราที่ทำให้เกิดโรคหรือ oomycetes
คุณสมบัติเฉพาะของกรดเออร์เบโนนิกและอนุพันธ์ของกรดมีประโยชน์ในการพัฒนาเป็นสารกำจัดวัชพืชและใช้เป็นเครื่องมือในการวิจัยความสำคัญของโครงร่างโครงร่างในการควบคุมรูปร่างของเซลล์พืชได้รับการยอมรับอย่างกว้างขวางการศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าพืชมีการพัฒนากลไกที่ซับซ้อนของการจัดระเบียบไมโครทูบูลในเยื่อหุ้มสมองโดยการควบคุมไดนามิกของไมโครทูบูลเพื่อควบคุมการเกิดสัณฐานวิทยาอย่างเหมาะสมมีการระบุโมเลกุลจำนวนมากที่รับผิดชอบในการควบคุมกิจกรรมของไมโครทูบูล และการวิจัยที่เกี่ยวข้องยังคงดำเนินอยู่3,4,28ความเข้าใจในปัจจุบันของเราเกี่ยวกับการเปลี่ยนแปลงของ microtubule ในเซลล์พืชไม่ได้อธิบายกลไกของการจัดระเบียบ microtubule ในเยื่อหุ้มสมองได้อย่างสมบูรณ์ตัวอย่างเช่น แม้ว่าทั้ง disopyramide และ oryzalin จะสามารถ depolymerize microtubules ได้ แต่ disopyramide ทำให้เกิดการบิดเบี้ยวของรากอย่างรุนแรง ในขณะที่ oryzalin มีผลค่อนข้างน้อยยิ่งไปกว่านั้น การกลายพันธุ์ในทูบูลิน ซึ่งทำให้ไมโครทูบูลคงตัว ยังทำให้เกิดการเดกซ์โตรโรเตชั่นในรากด้วย ในขณะที่แพ็กลิแทกเซลซึ่งยังทำให้ไมโครทูบูลมีความเสถียรด้วยก็ไม่ได้เป็นเช่นนั้นดังนั้น การศึกษาและการระบุเป้าหมายระดับโมเลกุลของกรดเออร์โซลิกควรให้ข้อมูลเชิงลึกใหม่เกี่ยวกับการควบคุมไมโครทูบูลในเปลือกพืชในทำนองเดียวกัน การเปรียบเทียบในอนาคตของสารเคมีที่มีประสิทธิภาพในการส่งเสริมการเจริญเติบโตที่บิดเบี้ยว เช่น ไดโซไพราไมด์ และสารเคมีที่มีประสิทธิภาพน้อยกว่า เช่น โอรีซาลินหรือกรดคุมะโมโตริก จะให้เบาะแสว่าการเจริญเติบโตที่บิดเบี้ยวเกิดขึ้นได้อย่างไร
ในทางกลับกัน การจัดเรียงไซโตสเกเลทัลที่เกี่ยวข้องกับการป้องกันเป็นอีกความเป็นไปได้หนึ่งที่จะอธิบายความเป็นพิษต่อเซลล์ของกรดเออร์โซนิกการติดเชื้อของเชื้อโรคหรือการแนะนำตัวกระตุ้นเข้าไปในเซลล์พืชบางครั้งทำให้เกิดการทำลายโครงร่างโครงร่างและการตายของเซลล์ในเวลาต่อมาตัวอย่างเช่น cryptoxanthin ที่ได้มาจาก oomycete ได้รับการรายงานว่ารบกวน microtubules และเส้นใยแอคตินก่อนที่เซลล์ยาสูบจะตาย คล้ายกับสิ่งที่เกิดขึ้นกับการรักษา KANDความคล้ายคลึงกันระหว่างการตอบสนองการป้องกันและการตอบสนองของเซลล์ที่เกิดจากกรดเออร์โซนิกทำให้เราตั้งสมมติฐานว่าพวกมันกระตุ้นกระบวนการเซลล์ทั่วไป แม้ว่าผลของกรดเออร์โซนิกจะเร็วขึ้นและแข็งแกร่งกว่าคริปโตแซนธินก็ตามอย่างไรก็ตาม การศึกษาพบว่าการหยุดชะงักของเส้นใยแอคตินส่งเสริมการตายของเซลล์ที่เกิดขึ้นเอง ซึ่งไม่ได้มาพร้อมกับการหยุดชะงักของไมโครทูบูลเสมอไปนอกจากนี้ จะต้องดูต่อไปว่าเชื้อโรคหรือตัวกระตุ้นทำให้เกิดการเจริญเติบโตของรากที่บิดเบี้ยว เช่นเดียวกับอนุพันธ์ของกรดเออร์โซนิกหรือไม่ดังนั้นความรู้ระดับโมเลกุลที่เชื่อมโยงการตอบสนองการป้องกันและโครงกระดูกจึงเป็นปัญหาที่น่าสนใจที่ต้องแก้ไขด้วยการใช้ประโยชน์จากการมีสารประกอบน้ำหนักโมเลกุลต่ำที่เกี่ยวข้องกับกรดเออร์โซนิก เช่นเดียวกับอนุพันธ์หลายชนิดที่มีความแรงต่างกัน พวกมันอาจให้โอกาสในการกำหนดเป้าหมายกลไกของเซลล์ที่ไม่รู้จัก
เมื่อนำมารวมกัน การค้นพบและการประยุกต์ใช้สารประกอบใหม่ๆ ที่ปรับเปลี่ยนไดนามิกของไมโครทูบูลจะเป็นวิธีการที่มีประสิทธิภาพในการจัดการกับกลไกระดับโมเลกุลที่ซับซ้อนซึ่งเป็นรากฐานของการกำหนดรูปร่างของเซลล์พืชในบริบทนี้ กรดเออร์โมโทนิกผสมที่พัฒนาขึ้นเมื่อเร็วๆ นี้ ซึ่งส่งผลต่อไมโครทูบูลและเส้นใยแอกติน และกระตุ้นให้เซลล์ตาย อาจให้โอกาสในการถอดรหัสความเชื่อมโยงระหว่างการควบคุมไมโครทูบูลกับกลไกอื่นๆ เหล่านี้ดังนั้นการวิเคราะห์ทางเคมีและชีวภาพโดยใช้กรดเออร์เบโนนิกจะช่วยให้เราเข้าใจกลไกการควบคุมระดับโมเลกุลที่ควบคุมโครงร่างโครงร่างของพืช
เพาะเชื้อ S. werraensis MK493-CF1 ลงในขวด Erlenmeyer แบบงงงันขนาด 500 มล. ที่บรรจุเมล็ดขนาดกลาง 110 มล. ซึ่งประกอบด้วยกาแลคโตส 2% (w/v) เพสต์เอสเซ้นส์ 2% (w/v) องค์ประกอบของแบคโต 1% (w/v) .-ถั่วเหลือง (Thermo Fisher Scientific, Inc.), สารสกัดข้าวโพด 0.5% (w/v) (KOGOSTCH Co., Ltd., ญี่ปุ่น), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 และ 0.2% CaCO3 ในน้ำปราศจากไอออน(pH 7.4 ก่อนการฆ่าเชื้อ)การเพาะเลี้ยงเมล็ดถูกบ่มบนเครื่องเขย่าแบบหมุน (180 รอบต่อนาที) ที่ 27°C เป็นเวลา 2 วันการเพาะปลูกผลผลิตด้วยการหมักแบบโซลิดสเตตย้ายการเพาะเมล็ด (7 มล.) ลงในขวด K-1 ขนาด 500 มล. ที่บรรจุสื่อการผลิต 40 กรัม ซึ่งประกอบด้วยข้าวบาร์เลย์กด 15 กรัม (MUSO Co., Ltd., ญี่ปุ่น) และน้ำปราศจากไอออน 25 กรัม (ไม่ได้ปรับ pH ก่อนการฆ่าเชื้อ)-การหมักดำเนินการที่อุณหภูมิ 30°C ในความมืดเป็นเวลา 14 วันวัสดุการหมักถูกสกัดด้วย EtOH 40 มล./ขวด และปั่นเหวี่ยง (1500 ก, 4°C, 10 นาที)ส่วนลอยเหนือตะกอนสำหรับการเพาะเลี้ยง (60 มล.) ถูกสกัดด้วยของผสมของ 10% MeOH/EtOAcชั้นอินทรีย์ถูกระเหยภายใต้ความดันลดลงเพื่อให้ได้สารตกค้าง (59.5 มก.) ซึ่งอยู่ภายใต้ HPLC ด้วยการชะล้างแบบเกรเดียนต์ (0–10 นาที: 90%) บนคอลัมน์เฟสย้อนกลับ (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 มม. × ยาว 250 มม.) H2O/CH3CN, 10–35 นาที: 90% H2O/CH3CN ถึง 70% H2O/CH3CN (ไล่ระดับ), 35–45 นาที: 90% H2O/EtOH, 45–155 นาที: 90% H2O /EtOH ถึง 100% EtOH (การไล่ระดับสี (การไล่ระดับสี), 155–200 นาที: 100% EtOH) ที่อัตราการไหล 1.5 มล./นาที, คูมาโมนาไมด์ (1, 36.0 มก.) ถูกแยกออกเป็นผงอสัณฐานสีขาว
คุมาโมโตเอไมด์(1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t , J = 3.8 Hz, 1H)), 4.08 (วินาที, 3H);13C-NMR (125 เมกะเฮิรตซ์, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ ค่าที่คำนวณได้: 141.0659, ค่าที่วัดได้: 141.0663, IR νสูงสุด 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1
ได้รับเมล็ดโคลัมเบีย (Col-0) จากศูนย์ทรัพยากรชีวภาพ Arabidopsis (ABRC) โดยได้รับอนุญาตเพื่อใช้ในการวิจัยเมล็ด Col-0 ได้รับการเผยแพร่และดูแลรักษาภายใต้สภาพห้องปฏิบัติการของเรา และใช้เป็นพืชอาราบิดอปซิสชนิดป่าเมล็ดอาราบิดซิสถูกฆ่าเชื้อบนพื้นผิวและเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ Murashige และ Skoog ที่มีความเข้มข้นครึ่งหนึ่งซึ่งมีซูโครส 2% (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) ( Fujifilm Wako Pure Chemical ).) และวุ้น 1.5% (Fujifilm Wako Pure Chemical) pH 5.7 ที่ 23 °C และแสงคงที่เมล็ดพันธุ์ของการกลายพันธุ์ phs1-1 จัดทำโดย T. Hashimoto (สถาบันวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีนารา)
เมล็ดพันธุ์ SR-1 จัดทำโดย T. Hashimoto (สถาบันวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีนารา) และใช้เป็นพืชยาสูบป่าเมล็ดยาสูบถูกฆ่าเชื้อบนพื้นผิวและแช่ในน้ำปลอดเชื้อเป็นเวลาสามคืนเพื่อส่งเสริมการงอก จากนั้นใส่ในสารละลายครึ่งความเข้มข้นที่ประกอบด้วยซูโครส 2%, MES 0.05% (w/v) และเจลแลนกัม 0.8% (Fujifilm Wako Pure Chemical) มูราชิเกะ.และตัวกลางสคูก) ที่มีค่า pH 5.7 และบ่มที่อุณหภูมิ 23°C ภายใต้แสงคงที่
สายพันธุ์ Tak-1 จัดทำโดย T. Kohchi (มหาวิทยาลัยเกียวโต) และใช้เป็นหน่วยทดลองมาตรฐานสำหรับการศึกษาตับเวิร์ตGemma ได้มาจากพืชเพาะเลี้ยงที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วชุบบนอาหาร Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) ที่มีซูโครส 1% และเจลแลนกัม 0.3% และบ่มที่อุณหภูมิ 23°C ภายใต้แสงต่อเนื่อง
เซลล์ยาสูบ BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) จัดทำโดย S. Hasezawa (มหาวิทยาลัยโตเกียว)เซลล์ BY-2 ถูกเจือจาง 95 เท่าในตัวกลาง Linsmeier และ Skoog ที่ดัดแปลง และเสริมทุกสัปดาห์ด้วยกรด 2,4-dichlorophenoxyacetic 32สารแขวนลอยของเซลล์ถูกผสมบนเครื่องเขย่าแบบหมุนที่ 130 รอบต่อนาทีที่ 27°C ในที่มืดล้างเซลล์ด้วยปริมาตรของตัวกลางสด 10 เท่า และแขวนลอยใหม่ในตัวกลางเดียวกันเส้นเซลล์ดัดแปรพันธุกรรม BY-2 แสดงเครื่องหมาย microtubule TagRFP-TUA6 หรือเครื่องหมายเส้นใยแอคติน GFP-ABD2 อย่างเสถียรภายใต้โปรโมเตอร์ไวรัสกะหล่ำดอกโมเสค 35S ถูกสร้างขึ้นตามที่อธิบายไว้เส้นเซลล์เหล่านี้สามารถรักษาและซิงโครไนซ์ได้โดยใช้ขั้นตอนที่คล้ายกับที่ใช้สำหรับเส้นเซลล์ BY-2 ดั้งเดิม
เพาะเลี้ยงเซลล์ HeLa ในอาหารเลี้ยงเชื้อ Eagle's (DMEM) (Life Technologies) ที่ได้รับการดัดแปลงของ Dulbecco เสริมด้วยซีรั่มของวัวของทารกในครรภ์ 10%, เพนิซิลิน 1.2 U/มล. และสเตรปโตมัยซิน 1.2 ไมโครกรัม/มล. ในตู้ฟัก 37°C ที่มี CO2 5%
การทดลองทั้งหมดที่อธิบายไว้ในต้นฉบับนี้ดำเนินการตามกฎระเบียบและแนวปฏิบัติด้านความปลอดภัยทางชีวภาพของญี่ปุ่น
สารประกอบถูกละลายในไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) เป็นสารละลายสต็อกและเจือจางในตัวกลาง MS สำหรับอาราบิดอปซิสและยาสูบ หรือตัวกลาง Gamborg B5 สำหรับตับเวิร์ตสำหรับการทดสอบการยับยั้งการเจริญเติบโตของราก มีการหว่านเมล็ดมากกว่า 10 เมล็ดต่อจานบนอาหารเลี้ยงเชื้อวุ้นที่มีสารประกอบหรือ DMSO ที่ระบุเพาะเมล็ดไว้ในตู้เพาะเป็นเวลา 7 วันถ่ายภาพต้นกล้าและวัดความยาวของรากสำหรับการทดสอบการงอกของอาราบิดอปซิส จะมีการหว่านเมล็ด 48 เมล็ดต่อจานบนอาหารเลี้ยงเชื้อวุ้นที่มีสารประกอบ 200 ไมโครโมลาร์หรือ DMSOเพาะเมล็ดอาราบิดซิสในห้องปลูกและนับจำนวนต้นกล้าที่งอกหลังจากงอก 7 วัน (dag)สำหรับการทดสอบการงอกของยาสูบ จะมีการหว่านเมล็ด 24 เมล็ดต่อจานบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่มี KAND หรือ DMSO 200 ไมโครโมลาร์เพาะเมล็ดยาสูบในห้องปลูกและนับจำนวนต้นกล้าที่งอกหลังจากผ่านไป 14 วันสำหรับการทดสอบการยับยั้งการเจริญเติบโตของตับเวิร์ต ตัวอ่อน 9 ตัวจากแต่ละจานถูกชุบบนอาหารเลี้ยงเชื้อวุ้นซึ่งมีความเข้มข้นที่ระบุของ KAND หรือ DMSO และบ่มในห้องเจริญเติบโตเป็นเวลา 14 วัน
ใช้ต้นกล้าที่ย้อมด้วยโพรพิเดียมไอโอไดด์ (PI) 5 มก./มล. เพื่อให้เห็นภาพการเรียงตัวของเนื้อเยื่อรากสัญญาณ PI ถูกสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์โดยใช้กล้องจุลทรรศน์สแกนด้วยเลเซอร์คอนโฟคอล TCS SPE (Leica Microsystems)
การย้อมสีฮิสโตเคมีของรากด้วย β-glucuronidase (GUS) ดำเนินการตามระเบียบวิธีที่อธิบายโดย Malami และ Benfeyตรึงต้นกล้าไว้ในอะซิโตน 90% ข้ามคืน ย้อมด้วยกรด 5-โบรโม-4-คลอโร-3-อินโดลิล-β-d-กลูโคโรนิก 0.5 มก./มล. ในบัฟเฟอร์ GUS เป็นเวลา 1 ชั่วโมง แล้วใส่ในสารละลายไฮเดรตคลอราลดีไฮด์(คลอราลไฮเดรต 8 กรัม น้ำ 2 มิลลิลิตร และกลีเซอรอล 1 มิลลิลิตร) และสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนทราสต์การรบกวนแบบดิฟเฟอเรนเชียลโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ Axio Imager M1 (Carl Zeiss)
วัดมุมของรากบนต้นกล้าอายุ 7 วันที่ปลูกบนจานที่วางในแนวตั้งวัดมุมของรากจากทิศทางของเวกเตอร์แรงโน้มถ่วงตามที่อธิบายไว้ในขั้นตอนที่ 6
สังเกตการจัดเรียงไมโครทูบูลของเยื่อหุ้มสมองตามที่อธิบายไว้ โดยมีการปรับเปลี่ยนโปรโตคอล 37 เล็กน้อยแอนติบอดีต่อต้าน β-tubulin (KMX-1, Merk มิลลิพอร์: MAB3408) และ IgG ต่อต้านเมาส์คอนจูเกตของ Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) ถูกใช้เป็นแอนติบอดีปฐมภูมิและทุติยภูมิที่การเจือจาง 1:1000 และ 1:100 ตามลำดับภาพเรืองแสงได้มาจากกล้องจุลทรรศน์สแกนเลเซอร์คอนโฟคอล TCS SPE (Leica Microsystems)รับภาพ Z-stack และสร้างการฉายภาพความเข้มสูงสุดตามคำแนะนำของผู้ผลิต
การสอบวิเคราะห์การเพิ่มจำนวนเซลล์ HeLa ดำเนินการโดยใช้ชุดนับจำนวนเซลล์ 8 (โดจินโด) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต
การเจริญเติบโตของ E. coli DH5α ได้รับการวิเคราะห์โดยการวัดความหนาแน่นของเซลล์ในการเพาะเลี้ยงโดยใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ที่ 600 นาโนเมตร (OD600)
การจัดเรียงเซลล์โครงร่างในเซลล์ BY-2 ดัดแปลงพันธุกรรมถูกสังเกตโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ที่ติดตั้งอุปกรณ์สแกนคอนโฟคอล CSU-X1 (โยโกกาวา) และกล้อง sCMOS (Zyla, เทคโนโลยีอันดอร์)ประเมินความหนาแน่นของไซโตสเกเลทัลโดยการวิเคราะห์ภาพ ซึ่งวัดปริมาณเปอร์เซ็นต์ของพิกเซลไซโตสเกเลทัลระหว่างพิกเซลไซโตพลาสซึมในภาพคอนโฟคอลโดยใช้ซอฟต์แวร์ ImageJ ตามที่อธิบายไว้
เพื่อตรวจจับการตายของเซลล์ในเซลล์ BY-2 ส่วนลงตัวของเซลล์แขวนลอยถูกบ่มด้วยอีแวนส์บลู 0.05% เป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้องการย้อมสีน้ำเงินแบบ Selective Evans ของเซลล์ที่ตายแล้วนั้นขึ้นอยู่กับการอัดขึ้นรูปของสีย้อมจากเซลล์ที่มีชีวิตโดยพลาสมาเมมเบรนที่ไม่เสียหายสังเกตเซลล์ที่เปื้อนโดยใช้กล้องจุลทรรศน์สนามสว่าง (BX53, Olympus)
เซลล์ HeLa ถูกทำให้เติบโตใน DMEM ที่เสริมด้วย 10% FBS ในตู้อบที่มีความชื้นที่ 37°C และ 5% CO2เซลล์ได้รับการบำบัดด้วย 100 μM KAND 11, กรดคุมะโมนามิก 6, คุมะโมนาไมด์ 1, 100 ng/ml คอลซีมิด (Gibco) หรือ 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) เป็นเวลา 6 ชั่วโมงที่ 37°Cเซลล์ถูกตรึงด้วย MetOH เป็นเวลา 10 นาที และจากนั้นด้วยอะซิเตตเป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้องเซลล์คงที่ถูกบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิ β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) เจือจางใน 0.5% BSA/PBS เป็นเวลา 2 ชั่วโมง ล้าง 3 ครั้งด้วย TBST จากนั้นบ่มด้วยแอนติบอดีแพะ Alexa Fluor488 1 ชม.– Mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) และ 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) เจือจางใน 0.5% BSA/PBSหลังจากล้างด้วย TBST สามครั้ง จะสังเกตเห็นเซลล์ที่เปื้อนด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบกลับหัวของ Nikon Eclipse Ti-Eภาพถูกจับด้วยกล้อง CCD Hamamatsu ORCA-R2 ที่ทำให้เย็นลงโดยใช้ซอฟต์แวร์ MetaMorph (อุปกรณ์ระดับโมเลกุล)
เวลาโพสต์: 17 มิ.ย.-2024