การค้นพบ การระบุลักษณะ และการปรับปรุงการทำงานของโมโนอะไมด์จากต้นเออร์ซาในฐานะสารยับยั้งการเจริญเติบโตของพืชชนิดใหม่ที่มีผลต่อไมโครทิวบูลของพืช

ขอบคุณที่เข้าชม Nature.com เบราว์เซอร์ที่คุณใช้อยู่มีการรองรับ CSS อย่างจำกัด เพื่อผลลัพธ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์เวอร์ชันใหม่กว่า (หรือปิดโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) ในระหว่างนี้ เพื่อให้มั่นใจว่าเราจะสามารถให้การสนับสนุนได้อย่างต่อเนื่อง เราจึงแสดงเว็บไซต์โดยไม่มีการจัดรูปแบบหรือ JavaScript
การค้นพบและการใช้ประโยชน์จากผลิตภัณฑ์ธรรมชาติสามารถช่วยปรับปรุงคุณภาพชีวิตของมนุษย์ได้ สารเคมีที่ยับยั้งการเจริญเติบโตของพืชถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในฐานะสารกำจัดวัชพืช เนื่องจากความจำเป็นต้องใช้สารกำจัดวัชพืชหลายประเภท จึงมีความจำเป็นต้องค้นหาสารประกอบที่มีกลไกการออกฤทธิ์ใหม่ ในการศึกษาครั้งนี้ เราได้ค้นพบสารประกอบ N-alkoxypyrrole ชนิดใหม่ คือ coumamonamide จาก Streptomyces werraensis MK493-CF1 และได้สร้างกระบวนการสังเคราะห์ที่สมบูรณ์ขึ้นมา จากการทดสอบฤทธิ์ทางชีวภาพ เราพบว่า urs-monoamic acid เป็นสารตัวกลางในการสังเคราะห์ urs-monoamide และมีศักยภาพในการเป็นสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพสารยับยั้งการเจริญเติบโตของพืชนอกจากนี้ เรายังได้พัฒนาอนุพันธ์ของกรดเออร์เบโนนิกหลายชนิด รวมถึงอนุพันธ์เออร์เบนิลออกซี (UDA) ซึ่งมีฤทธิ์ในการกำจัดวัชพืชสูงโดยไม่ส่งผลเสียต่อการเจริญเติบโตของเซลล์ HeLa เรายังพบว่าอนุพันธ์ของกรดเออร์โมโทนิกสามารถรบกวนไมโครทูบูลของพืชได้ นอกจากนี้ KAND ยังส่งผลต่อเส้นใยแอคตินและกระตุ้นให้เซลล์ตาย ผลกระทบหลายด้านเหล่านี้แตกต่างจากสารยับยั้งไมโครทูบูลที่รู้จักกัน และชี้ให้เห็นถึงกลไกการออกฤทธิ์ใหม่ของกรดเออร์โซนิก ซึ่งเป็นข้อได้เปรียบที่สำคัญในการพัฒนาสารกำจัดวัชพืชชนิดใหม่
การค้นพบและการประยุกต์ใช้ผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติที่เป็นประโยชน์และอนุพันธ์ของผลิตภัณฑ์เหล่านั้น เป็นวิธีการหนึ่งในการยกระดับคุณภาพชีวิตของมนุษย์ สารเมตาบอไลต์ทุติยภูมิที่ผลิตโดยจุลินทรีย์ พืช และแมลง ได้นำไปสู่ความก้าวหน้าครั้งสำคัญในด้านการแพทย์และการเกษตร ยาปฏิชีวนะและยาต้านมะเร็งเม็ดเลือดขาวหลายชนิดได้รับการพัฒนามาจากผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติ นอกจากนี้ ยังมีสารประเภทต่างๆ อีกมากมายสารกำจัดศัตรูพืชสารฆ่าเชื้อราและสารกำจัดวัชพืชถูกสกัดจากผลิตภัณฑ์ธรรมชาติเหล่านี้เพื่อใช้ในการเกษตร โดยเฉพาะอย่างยิ่ง สารกำจัดวัชพืชเป็นเครื่องมือสำคัญในการเพิ่มผลผลิตพืชผลทางการเกษตรสมัยใหม่ และสารประกอบหลายประเภทได้ถูกนำมาใช้ในเชิงพาณิชย์แล้ว กระบวนการระดับเซลล์หลายอย่างในพืช เช่น การสังเคราะห์แสง การเผาผลาญกรดอะมิโน การสังเคราะห์ผนังเซลล์ การควบคุมการแบ่งเซลล์ การส่งสัญญาณฮอร์โมนพืช หรือการสังเคราะห์โปรตีน ถือเป็นเป้าหมายทั่วไปของสารกำจัดวัชพืช สารประกอบที่ยับยั้งการทำงานของไมโครทิวบูลเป็นสารกำจัดวัชพืชประเภทหนึ่งที่ส่งผลต่อการเจริญเติบโตของพืชโดยส่งผลต่อการควบคุมการแบ่งเซลล์²
ไมโครทิวบูลเป็นส่วนประกอบของโครงร่างเซลล์และมีการอนุรักษ์อย่างกว้างขวางในเซลล์ยูคาริโอต ทูบูลินเฮเทอโรไดเมอร์ประกอบด้วย α-ทูบูลินและ β-ทูบูลินที่สร้างโปรโตฟิลาเมนต์ไมโครทิวบูลเชิงเส้น โดยมีโปรโตฟิลาเมนต์ 13 เส้นก่อตัวเป็นโครงสร้างทรงกระบอก ไมโครทิวบูลมีบทบาทหลายอย่างในเซลล์พืช รวมถึงการกำหนดรูปร่างของเซลล์ การแบ่งเซลล์ และการขนส่งภายในเซลล์3,4 เซลล์พืชมีไมโครทิวบูลอยู่ใต้เยื่อหุ้มพลาสมาในระยะอินเตอร์เฟส และไมโครทิวบูลคอร์ติคัลเหล่านี้เชื่อว่าควบคุมการจัดระเบียบของไมโครไฟเบอร์เซลลูโลสผ่านการควบคุมคอมเพล็กซ์เซลลูโลสซินเทส4,5 ไมโครทิวบูลคอร์ติคัลของเซลล์ผิวหนังรากซึ่งอยู่ในบริเวณที่มีการยืดตัวอย่างรวดเร็วของปลายรากนั้นตั้งอยู่ด้านข้าง และไมโครไฟเบอร์เซลลูโลสจะตามไมโครทิวบูลเหล่านี้และจำกัดทิศทางการขยายตัวของเซลล์ จึงส่งเสริมการยืดตัวของเซลล์แบบไม่สมมาตร ดังนั้น หน้าที่ของไมโครทิวบูลจึงมีความเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับสัณฐานวิทยาของพืช การแทนที่กรดอะมิโนในยีนที่เข้ารหัสทูบูลินทำให้เกิดการเบี่ยงเบนของอาร์เรย์ไมโครทิวบูลในคอร์เทกซ์และการเจริญเติบโตด้านซ้ายหรือขวาใน Arabidopsis 6,7 ในทำนองเดียวกัน การกลายพันธุ์ในโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไมโครทิวบูลซึ่งควบคุมพลวัตของไมโครทิวบูลก็สามารถนำไปสู่การเจริญเติบโตของรากที่ผิดปกติได้เช่นกัน8,9,10,11,12,13 นอกจากนี้ การรักษาด้วยสารกำจัดวัชพืชที่รบกวนไมโครทิวบูล เช่น ไดโซไพรไมด์ หรือที่รู้จักกันในชื่อพรีทิลาคลอร์ ก็ทำให้เกิดการเจริญเติบโตของรากเฉียงไปทางด้านซ้ายเช่นกัน14 ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่าการควบคุมหน้าที่ของไมโครทิวบูลอย่างแม่นยำมีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการกำหนดทิศทางการเจริญเติบโตของพืช
มีการค้นพบสารยับยั้งไมโครทูบูลหลายประเภท และยาเหล่านี้มีส่วนสำคัญอย่างยิ่งต่อการวิจัยโครงสร้างเซลล์ ตลอดจนการเกษตรและการแพทย์² โดยเฉพาะอย่างยิ่ง โอไรซาลิน สารประกอบไดไนโตรอะนิลีน ไดโซไพรไมด์ สารประกอบที่เกี่ยวข้องกับเบนซาไมด์ และสารอนาล็อกของสารเหล่านี้ สามารถยับยั้งการทำงานของไมโครทูบูลและยับยั้งการเจริญเติบโตของพืชได้ ดังนั้นจึงมีการใช้กันอย่างแพร่หลายในฐานะสารกำจัดวัชพืช อย่างไรก็ตาม เนื่องจากไมโครทูบูลเป็นส่วนประกอบที่สำคัญของเซลล์พืชและเซลล์สัตว์ สารยับยั้งไมโครทูบูลส่วนใหญ่จึงเป็นพิษต่อเซลล์ทั้งสองชนิด ดังนั้น แม้จะได้รับการยอมรับว่ามีประโยชน์ในฐานะสารกำจัดวัชพืช แต่ก็มีสารต้านไมโครทูบูลเพียงจำนวนจำกัดเท่านั้นที่ถูกนำมาใช้ในทางปฏิบัติ
สเตรปโตไมเซส (Streptomyces) เป็นสกุลหนึ่งในวงศ์สเตรปโตไมเซส (Streptomyces) ซึ่งประกอบด้วยแบคทีเรียแกรมบวกแบบเส้นใยที่เจริญเติบโตได้ในสภาวะที่มีออกซิเจน และเป็นที่รู้จักกันอย่างแพร่หลายในด้านความสามารถในการผลิตสารเมตาโบไลต์ทุติยภูมิหลากหลายชนิด ดังนั้นจึงถือเป็นหนึ่งในแหล่งที่สำคัญที่สุดของผลิตภัณฑ์ธรรมชาติที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพใหม่ๆ ในการศึกษาครั้งนี้ เราได้ค้นพบสารประกอบใหม่ที่เรียกว่า คูมาโมนาไมด์ (coumamonamide) ซึ่งแยกได้จากสเตรปโตไมเซส เวอร์ราเอนซิส (Streptomyces werraensis) สายพันธุ์ MK493-CF1 และ S. werraensis ISP 5486 โดยใช้การวิเคราะห์สเปกตรัมและการวิเคราะห์สเปกตรัมแบบเต็มรูปแบบ เราได้ระบุโครงสร้างของคูมาโมนาไมด์และกำหนดโครงสร้าง N-alkoxypyrrole ที่เป็นเอกลักษณ์เฉพาะตัว นอกจากนี้ ยังพบว่ากรดเออร์สโมนิก (Ursmonic acid) ซึ่งเป็นสารตัวกลางในการสังเคราะห์เออร์สโมนาไมด์และอนุพันธ์ของมัน สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตและการงอกของพืชต้นแบบที่นิยมใช้คือ อาราบิโดปซิส ทาเลียนา (Arabidopsis thaliana) จากการศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างและฤทธิ์ทางชีวภาพ เราพบว่าสารประกอบที่มีการดัดแปลง C9 ให้เป็นกรดเออร์โซนิก ซึ่งเรียกว่าอนุพันธ์โนนิลออกซีของกรดเออร์โซนิก (KAND) มีฤทธิ์ยับยั้งการเจริญเติบโตและการงอกของเมล็ดพืชอย่างมีนัยสำคัญ ที่น่าสังเกตคือ สารยับยั้งการเจริญเติบโตของพืชที่ค้นพบใหม่นี้ยังมีผลต่อการเจริญเติบโตของยาสูบและมอส และไม่เป็นพิษต่อแบคทีเรียหรือเซลล์ HeLa ยิ่งไปกว่านั้น อนุพันธ์ของกรดเออร์โมโทนิกบางชนิดทำให้เกิดลักษณะรากที่ผิดปกติ ซึ่งบ่งชี้ว่าอนุพันธ์เหล่านี้มีผลต่อไมโครทิวบูลโดยตรงหรือโดยอ้อม สอดคล้องกับแนวคิดนี้ การสังเกตไมโครทิวบูลที่ติดฉลากด้วยวิธีทางอิมมูโนฮิสโตเคมีหรือโปรตีนเรืองแสงแสดงให้เห็นว่าการรักษาด้วย KAND ทำให้ไมโครทิวบูลสลายตัว นอกจากนี้ การรักษาด้วยอนุพันธ์ของกรดคูมาโมโทนิกยังทำให้ไมโครฟิลาเมนต์ของแอคตินเสียหาย ดังนั้น เราจึงค้นพบสารยับยั้งการเจริญเติบโตของพืชชนิดใหม่ที่มีกลไกการออกฤทธิ์เฉพาะตัวซึ่งเกี่ยวข้องกับการทำลายโครงสร้างเซลล์
สายพันธุ์ MK493-CF1 ถูกแยกได้จากดินในเขตชินากาวะ โตเกียว สายพันธุ์ MK493-CF1 สร้างเส้นใยสโตรมัลที่มีการแตกแขนงอย่างดี มีการกำหนดลำดับบางส่วนของยีน 16S ribosomal RNA (1422 bp) สายพันธุ์นี้มีความคล้ายคลึงกับ S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: สายพันธุ์ทั่วไป, 99.93%) จากผลลัพธ์นี้ จึงสรุปได้ว่าสายพันธุ์นี้มีความสัมพันธ์ใกล้ชิดกับสายพันธุ์ต้นแบบของ S. werraensis ดังนั้น เราจึงตั้งชื่อสายพันธุ์นี้ชั่วคราวว่า S. werraensis MK493-CF1 S. werraensis ISP 5486T ก็ผลิตสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพชนิดเดียวกันด้วย เนื่องจากมีการวิจัยเบื้องต้นเกี่ยวกับการสกัดผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติจากจุลินทรีย์ชนิดนี้น้อยมาก จึงได้มีการดำเนินการวิจัยทางเคมีเพิ่มเติม หลังจากเพาะเลี้ยง S. werraensis MK493-CF1 ในอาหารเลี้ยงเชื้อข้าวบาร์เลย์โดยวิธีการหมักแบบของแข็งที่อุณหภูมิ 30°C เป็นเวลา 14 วัน ได้ทำการสกัดอาหารเลี้ยงเชื้อด้วยเอทานอล 50% นำตัวอย่าง 60 มิลลิลิตรไปอบแห้งเพื่อให้ได้สารสกัดดิบ 59.5 มิลลิกรัม จากนั้นนำสารสกัดดิบไปแยกด้วย HPLC แบบเฟสผกผัน ได้ N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, ตั้งชื่อว่า coumamotoamide, 36.0 มิลลิกรัม) ปริมาณรวมของสาร 1 คิดเป็นประมาณ 60% ของสารสกัดดิบทั้งหมด ดังนั้นเราจึงตัดสินใจศึกษาคุณสมบัติของ kumamotoamide 1 อย่างละเอียดต่อไป
คูมาโมนาไมด์ 1 เป็นผงอสัณฐานสีขาว และการวิเคราะห์ด้วยสเปกโทรเมตรีมวลความละเอียดสูง (HRESIMS) ยืนยันว่ามีสูตรเคมี C6H8N2O2 (รูปที่ 1) ส่วนประกอบไพร์โรลที่ถูกแทนที่ด้วยหมู่ C2 ของสารประกอบนี้มีลักษณะเฉพาะด้วย δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH ในสเปกตรัม 1H NMR: 4.5 Hz, H-5) และ δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) และสเปกตรัม 13C NMR แสดงให้เห็นถึงการมีอยู่ของอะตอมคาร์บอน sp2 สี่อะตอม การมีอยู่ของหมู่เอไมด์ที่ตำแหน่ง C2 ได้รับการประเมินโดยความสัมพันธ์ HMBC จากโปรตอน C-3 ไปยังคาร์บอนคาร์บอนิลของเอไมด์ที่ δC 161.1 นอกจากนี้ พีค 1H และ 13C NMR ที่ δH 4.10 (3H, S) และ δC 68.3 บ่งชี้ว่ามีหมู่ N-methoxy อยู่ในโมเลกุล แม้ว่าตำแหน่งที่ถูกต้องของหมู่ methoxy ยังไม่ได้รับการกำหนดโดยใช้การวิเคราะห์ทางสเปกโทรสโกปี เช่น enhanced difference spectroscopy และ nuclear Overhauser abbreviation (NOEDF) แต่ N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide ก็กลายเป็นสารประกอบตัวเลือกแรก
เพื่อกำหนดโครงสร้างที่ถูกต้องของ 1 จึงได้ทำการสังเคราะห์ทั้งหมด (รูปที่ 2a) การบำบัด 2-อะมิโนไพริดีน 2 ที่มีจำหน่ายในเชิงพาณิชย์ด้วย m-CPBA ส่งผลให้ได้ N-ออกไซด์ 3 ที่สอดคล้องกันในปริมาณที่ได้ผลผลิตเชิงปริมาณ หลังจาก 2-อะมิโนอะซิเดชันของ 2 แล้ว ปฏิกิริยาการควบแน่นแบบวงแหวนที่อธิบายโดย Abramovich ได้ถูกดำเนินการในเบนซีนที่อุณหภูมิ 90°C เพื่อให้ได้ 1-ไฮดรอกซี-1H-ไพร์โรล-2-คาร์บอนไนไตรล์ 5 ที่ต้องการเป็นกรัม ความเร็ว 60% (สองขั้นตอน) 15,16 จากนั้นการเมทิลเลชันและการไฮโดรไลซิสของ 4 ทำให้ได้ 1-เมทอกซี-1H-ไพร์โรล-2-คาร์บอกซิลิกแอซิด (เรียกว่า “กรดคูโมโทนิก” 6) ในผลผลิตที่ดี (70% สองขั้นตอน) สุดท้าย การอะมิเดชันผ่านตัวกลางกรดคลอไรด์ 6 โดยใช้แอมโมเนียในน้ำทำให้ได้คูมาโมโตะอะไมด์ 1 ในผลผลิต 98% ข้อมูลสเปกตรัมทั้งหมดของสาร 1 ที่สังเคราะห์ขึ้นนั้นคล้ายคลึงกับสาร 1 ที่แยกได้ ดังนั้นจึงสามารถกำหนดโครงสร้างของสาร 1 ได้
การสังเคราะห์ทั่วไปและการวิเคราะห์ฤทธิ์ทางชีวภาพของเออร์เบนาไมด์และกรดเออร์เบนิก (ก) การสังเคราะห์คุมาโมโตะอะไมด์ทั้งหมด (ข) ต้นกล้าอาราบิโดปซิสสายพันธุ์ป่าโคลัมเบีย (Col) อายุ 7 วัน ถูกปลูกบนจาน Murashige and Skoog (MS) ที่มีคูมาโมนาไมด์ 6 หรือคูมาโมนาไมด์ 1 ในความเข้มข้นที่ระบุไว้ แถบมาตราส่วน = 1 ซม.
ขั้นแรก เราได้ประเมินฤทธิ์ทางชีวภาพของเออร์เบนาไมด์และสารตัวกลางของมันในด้านความสามารถในการควบคุมการเจริญเติบโตของพืช เราเติมเออร์สมอนาไมด์ 1 หรือกรดเออร์สมอนิก 6 ในความเข้มข้นต่างๆ ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ MS agar และเพาะเลี้ยงต้นกล้า Arabidopsis thaliana บนอาหารเลี้ยงเชื้อนี้ การทดสอบเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าความเข้มข้นสูง (500 μM) ของ 6 ยับยั้งการเจริญเติบโตของราก (รูปที่ 2b) ต่อมา เราได้สร้างอนุพันธ์ต่างๆ โดยการแทนที่ตำแหน่ง N1 ของ 6 และทำการศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างและฤทธิ์ทางชีวภาพ (กระบวนการสังเคราะห์อะนาล็อกอธิบายไว้ในข้อมูลสนับสนุน (SI)) ต้นกล้า Arabidopsis ถูกปลูกบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีอนุพันธ์กรดเออร์สมอนิก 50 μM และวัดความยาวของราก ดังแสดงในภาพ ดังแสดงในรูปที่ 3a, b และ S1 กรดคูมาโมมีสายโซ่แอลคอกซีเชิงเส้นที่มีความยาวต่างกัน (9, 10, 11, 12 และ 13) หรือสายโซ่แอลคอกซีขนาดใหญ่ (15, 16 และ 17) ที่ตำแหน่ง N1 อนุพันธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นถึงการยับยั้งการเจริญเติบโตของรากอย่างมีนัยสำคัญ นอกจากนี้ เราพบว่าการใช้ 10, 11 หรือ 17 ที่ความเข้มข้น 200 μM ยับยั้งการงอก (รูปที่ 3c และ S2)
การศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างและฤทธิ์ทางชีวภาพของคูมาโมโตะอะไมด์และสารประกอบที่เกี่ยวข้อง (ก) โครงสร้างและแผนผังการสังเคราะห์ของสารอนาล็อก (ข) การวัดความยาวรากของต้นกล้าอายุ 7 วันที่ปลูกบนอาหารเลี้ยงเชื้อ MS โดยมีหรือไม่มีอนุพันธ์คูมาโมนาไมด์ 50 μM เครื่องหมายดอกจันแสดงถึงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (การทดสอบ t, p < 0.05)< 0.05) n>18. ข้อมูลแสดงในรูปค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน nt หมายถึง “ไม่ได้ทดสอบ” เนื่องจากเมล็ดมากกว่า 50% ไม่งอก (c) การหาปริมาณอัตราการงอกของเมล็ดที่ได้รับการบำบัด บ่มเป็นเวลา 7 วันในอาหารเลี้ยงเชื้อ MS ที่มีหรือไม่มีคูมาโมนาไมด์ 200 μM และสารประกอบที่เกี่ยวข้อง เครื่องหมายดอกจันแสดงถึงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญกับการบำบัดแบบหลอก (การทดสอบไคสแควร์) n=96
ที่น่าสนใจคือ การเพิ่มโซ่ข้างอัลคิลที่มีความยาวมากกว่า C9 ทำให้ฤทธิ์ยับยั้งลดลง ซึ่งบ่งชี้ว่าสารประกอบที่เกี่ยวข้องกับกรดคุมาโมโตอิกจำเป็นต้องมีโซ่ข้างที่มีขนาดที่แน่นอนเพื่อแสดงฤทธิ์ทางชีวภาพ
เนื่องจากการวิเคราะห์ความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างและกิจกรรมแสดงให้เห็นว่า C9 ถูกดัดแปลงเป็นกรดเออร์โซนิก และอนุพันธ์โนนิลออกซีของกรดเออร์โซนิก (ต่อไปนี้จะเรียกว่า KAND 11) เป็นสารยับยั้งการเจริญเติบโตของพืชที่มีประสิทธิภาพมากที่สุด เราจึงทำการศึกษาลักษณะเฉพาะของ KAND 11 อย่างละเอียดมากขึ้น การรักษา Arabidopsis ด้วย KAND 11 ที่ความเข้มข้น 50 μM สามารถป้องกันการงอกได้เกือบทั้งหมด ในขณะที่ความเข้มข้นที่ต่ำกว่า (40, 30, 20 หรือ 10 μM) ของ KAND 11 ยับยั้งการเจริญเติบโตของรากในลักษณะที่ขึ้นอยู่กับปริมาณ (รูปที่ 4a, b) เพื่อทดสอบว่า KAND 11 ส่งผลต่อความมีชีวิตของเนื้อเยื่อเจริญรากหรือไม่ เราจึงตรวจสอบเนื้อเยื่อเจริญรากที่ย้อมด้วยโพรพิเดียมไอโอไดด์ (PI) และวัดขนาดพื้นที่ของเนื้อเยื่อเจริญ ขนาดของเนื้อเยื่อเจริญของต้นกล้าที่ปลูกในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มี KAND-11 ความเข้มข้น 25 μM คือ 151.1 ± 32.5 μm ในขณะที่ขนาดของเนื้อเยื่อเจริญของต้นกล้าที่ปลูกในอาหารเลี้ยงเชื้อควบคุมที่มี DMSO คือ 264.7 ± 30.8 μm (รูปที่ 4c, d) ซึ่งแสดงให้เห็นว่า KAND-11 ช่วยฟื้นฟูการทำงานของเซลล์ การแพร่กระจายของเนื้อเยื่อเจริญราก สอดคล้องกับเรื่องนี้ การรักษาด้วย KAND-11 ลดปริมาณสัญญาณของตัวบ่งชี้การแบ่งเซลล์ CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS ในเนื้อเยื่อเจริญราก (รูปที่ 4e) 17 ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่า KAND-11 ยับยั้งการเจริญเติบโตของรากโดยการลดกิจกรรมการเพิ่มจำนวนเซลล์
การวิเคราะห์ผลยับยั้งการเจริญเติบโตของอนุพันธ์กรดเออร์เบโนนิก (อนุพันธ์เออร์เบนิลออกซี) (ก) ต้นกล้า Col ชนิดป่าอายุ 7 วัน ปลูกบนจาน MS ที่มี KAND 11 ความเข้มข้นตามที่ระบุไว้ แถบมาตราส่วน = 1 ซม. (ข) การวัดความยาวราก ตัวอักษรแสดงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (การทดสอบ Tukey HSD, p < 0.05)< 0.05) n>16. ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน (c) กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลของราก Col ชนิดป่าที่ย้อมด้วยโพรพิเดียมไอโอไดด์ที่ปลูกบนจาน MS ที่มีหรือไม่มี KAND 11 ความเข้มข้น 25 μM วงเล็บสีขาวแสดงถึงเนื้อเยื่อเจริญของราก แถบมาตราส่วน = 100 µm (d) การวัดปริมาณขนาดของเนื้อเยื่อเจริญของราก (n = 10 ถึง 11) ความแตกต่างทางสถิติถูกกำหนดโดยใช้การทดสอบ t (p < 0.05)< 0.05) แท่งแสดงถึงขนาดเฉลี่ยของเนื้อเยื่อเจริญ (e) กล้องจุลทรรศน์แบบความแตกต่างของการรบกวน (DIC) ของเนื้อเยื่อเจริญรากที่มีโครงสร้าง CDKB2; 1pro: CDKB2; ย้อมสี 1-GUS และย้อมสีบนต้นกล้าอายุ 5 วันที่ปลูกบนจาน MS ที่มีหรือไม่มีการทดสอบ KAND 25 µM
มีการทดสอบความเป็นพิษต่อพืชของ KAND 11 เพิ่มเติมโดยใช้พืชใบเลี้ยงคู่ชนิดอื่น คือ ยาสูบ (Nicotiana tabacum) และพืชบกที่เป็นแบบจำลองที่สำคัญ คือ มอส (Marchantia polymorpha) เช่นเดียวกับในกรณีของ Arabidopsis ต้นกล้ายาสูบ SR-1 ที่ปลูกในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มี KAND 11 ความเข้มข้น 25 μM มีรากสั้นกว่า (รูปที่ 5a) นอกจากนี้ เมล็ด 40 จาก 48 เมล็ดงอกบนจานเพาะเชื้อที่มี KAND 11 ความเข้มข้น 200 μM ในขณะที่เมล็ดทั้งหมด 48 เมล็ดงอกบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่ไม่ได้ผ่านการบำบัด แสดงให้เห็นว่าความเข้มข้นของ KAND ที่สูงขึ้นมีผลอย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.05)< 0.05; การทดสอบไคสแควร์) ยับยั้งการงอกของใบยาสูบ (รูปที่ 5b) นอกจากนี้ ความเข้มข้นของ KAND 11 ที่ยับยั้งการเจริญเติบโตของแบคทีเรียในมอสส์นั้นคล้ายคลึงกับความเข้มข้นที่มีประสิทธิภาพในอะราบิโดปซิส (รูปที่ 5c) ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า KAND 11 สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของพืชได้หลากหลายชนิด จากนั้นเราได้ตรวจสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ของสารประกอบที่เกี่ยวข้องกับโมโนอะไมด์ในสิ่งมีชีวิตอื่นๆ ได้แก่ เซลล์ HeLa ของมนุษย์และสายพันธุ์ Escherichia coli DH5α ซึ่งเป็นตัวแทนของเซลล์สัตว์ชั้นสูงและเซลล์แบคทีเรียตามลำดับ ในการทดสอบการเพิ่มจำนวนเซลล์หลายชุด เราพบว่าคูมาโมนาไมด์ 1, กรดคูมาโมนาไมดิก 6 และ KAND 11 ไม่ส่งผลกระทบต่อการเจริญเติบโตของเซลล์ HeLa หรือ E. coli ที่ความเข้มข้น 100 μM (รูปที่ 5d,e)
การยับยั้งการเจริญเติบโตของ KAND 11 ในสิ่งมีชีวิตที่ไม่ใช่ Arabidopsis (a) ต้นกล้ายาสูบ SR-1 สายพันธุ์ป่าอายุ 2 สัปดาห์ ถูกปลูกบนจาน MS ที่วางในแนวตั้งซึ่งมี KAND 11 ความเข้มข้น 25 μM (b) ต้นกล้ายาสูบ SR-1 สายพันธุ์ป่าอายุ 2 สัปดาห์ ถูกปลูกบนจาน MS ที่วางในแนวนอนซึ่งมี KAND 11 ความเข้มข้น 200 μM (c) ตาของมอส Tak-1 สายพันธุ์ป่าอายุ 2 สัปดาห์ ถูกปลูกบนจาน Gamborg B5 ที่มี KAND 11 ความเข้มข้นตามที่ระบุ ลูกศรสีแดงชี้ไปที่สปอร์ที่หยุดการเจริญเติบโตภายในระยะเวลาการบ่ม 2 สัปดาห์ (d) การทดสอบการเพิ่มจำนวนเซลล์ของเซลล์ HeLa จำนวนเซลล์ที่มีชีวิตถูกวัดในช่วงเวลาที่กำหนดโดยใช้ชุดตรวจนับเซลล์ 8 (Dojindo) สำหรับการควบคุม เซลล์ HeLa ถูกบำบัดด้วยแอคติโนไมซิน D (Act D) 5 μg/ml ซึ่งยับยั้งการถอดรหัสของ RNA polymerase และทำให้เซลล์ตาย ทำการวิเคราะห์ซ้ำ 3 ครั้ง (e) การทดสอบการเพิ่มจำนวนเซลล์ E. coli วิเคราะห์การเจริญเติบโตของ E. coli โดยการวัดค่า OD600 สำหรับกลุ่มควบคุม เซลล์ได้รับการบำบัดด้วยแอมพิซิลลิน (Amp) 50 μg/ml ซึ่งยับยั้งการสังเคราะห์ผนังเซลล์ของแบคทีเรีย ทำการวิเคราะห์ซ้ำ 3 ครั้ง
เพื่อถอดรหัสกลไกการออกฤทธิ์ของความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เกิดจากสารประกอบที่เกี่ยวข้องกับยูราไมด์ เราได้ทำการวิเคราะห์อนุพันธ์ของกรดเออร์เบนิกที่มีฤทธิ์ยับยั้งปานกลางอีกครั้ง ดังแสดงในภาพ ดังแสดงในรูปที่ 2b และ 6a ต้นกล้าที่ปลูกบนจานวุ้นที่มีกรดเออร์โมโทนิกความเข้มข้นสูง (200 μM) 6 จะมีรากที่สั้นกว่าและโค้งไปทางซ้าย (θ = – 23.7 ± 6.1) ในขณะที่ต้นกล้าที่ปลูกบนอาหารเลี้ยงเชื้อควบคุมจะมีรากเกือบตรง (θ = – 3.8 ± 7.1) ลักษณะการเจริญเติบโตแบบเฉียงนี้เป็นที่ทราบกันดีว่าเกิดจากการทำงานผิดปกติของไมโครทิวบูลในคอร์เทกซ์14,18 สอดคล้องกับผลการค้นพบนี้ ยาที่ทำให้ไมโครทิวบูลไม่เสถียรอย่างดิโซไพรไมด์และโอไรซาลินทำให้เกิดการเอียงของรากในลักษณะเดียวกันภายใต้สภาวะการเจริญเติบโตของเรา (รูปที่ 2b และ 6a) ในขณะเดียวกัน เราได้ทดสอบอนุพันธ์ของกรดเออร์โมโทนิกและคัดเลือกสารประกอบหลายชนิดที่ความเข้มข้นบางระดับสามารถกระตุ้นการเจริญเติบโตของรากในแนวเฉียงได้ สารประกอบหมายเลข 8, 9 และ 15 เปลี่ยนทิศทางการเจริญเติบโตของรากที่ความเข้มข้น 75 μM, 50 μM และ 40 μM ตามลำดับ ซึ่งแสดงให้เห็นว่าสารประกอบเหล่านี้สามารถทำให้ไมโครทูบูลไม่เสถียรได้อย่างมีประสิทธิภาพ (รูปที่ 2b, 6a) เรายังได้ทดสอบอนุพันธ์ของกรดเออร์โซลิกที่มีฤทธิ์แรงที่สุด คือ KAND 11 ที่ความเข้มข้นต่ำกว่า (15 µM) และพบว่าการใช้ KAND 11 ยับยั้งการเจริญเติบโตของราก และทิศทางการเจริญเติบโตของรากไม่สม่ำเสมอ แม้ว่าจะโน้มเอียงไปทางซ้ายก็ตาม (รูปที่ C3) เนื่องจากความเข้มข้นสูงของยาที่ทำให้ไมโครทูบูลไม่เสถียรบางครั้งอาจยับยั้งการเจริญเติบโตของพืชมากกว่าทำให้รากเอียง เราจึงประเมินความเป็นไปได้ที่ KAND 11 จะส่งผลต่อไมโครทูบูลโดยการสังเกตไมโครทูบูลในคอร์เทกซ์ของเซลล์ชั้นนอกของราก การตรวจทางอิมมูโนฮิสโตเคมีโดยใช้แอนติบอดีต่อ β-ทูบูลินในเซลล์ชั้นนอกของรากต้นกล้าที่ได้รับการบำบัดด้วย KAND 11 ความเข้มข้น 25 μM แสดงให้เห็นว่าไมโครทูบูลในคอร์เทกซ์เกือบทั้งหมดหายไปในเซลล์ชั้นนอกบริเวณการยืดตัว (รูปที่ 6b) ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่ากรดคูมาโมโทนิกและอนุพันธ์ของมันออกฤทธิ์โดยตรงหรือโดยอ้อมต่อไมโครทูบูลเพื่อทำลายพวกมัน และสารประกอบเหล่านี้เป็นสารยับยั้งไมโครทูบูลชนิดใหม่
กรดเออร์โซนิกและอนุพันธ์ของมันเปลี่ยนแปลงไมโครทูบูลในคอร์เทกซ์ของ Arabidopsis thaliana (a) มุมเอียงของรากที่วัดได้ใน présence ของอนุพันธ์ของกรดเออร์โซนิกที่ความเข้มข้นต่างๆ ที่ระบุไว้ นอกจากนี้ยังวิเคราะห์ผลของสารประกอบสองชนิดที่ทราบกันว่ายับยั้งไมโครทูบูล ได้แก่ ไดโซไพรไมด์และโอไรซาลิน ภาพแทรกแสดงมาตรฐานที่ใช้ในการวัดมุมการเจริญเติบโตของราก เครื่องหมายดอกจันแสดงถึงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญกับการรักษาแบบหลอก (การทดสอบ t, p < 0.05)< 0.05) n>19. แถบมาตราส่วน = 1 ซม. (b) ไมโครทิวบูลคอร์ติคัลในเซลล์ชั้นนอกสุดในโซนการยืดตัว ไมโครทิวบูลในราก Arabidopsis Col ชนิดป่าที่ปลูกบนจาน MS ที่มีหรือไม่มี KAND 11 25 μM ถูกมองเห็นได้ด้วยการย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมีโดยใช้แอนติบอดีหลัก β-tubulin และแอนติบอดีรองที่เชื่อมต่อกับ Alexa Fluor แถบมาตราส่วน = 10 µm (c) โครงสร้างไมโทซิสของไมโครทิวบูลในเนื้อเยื่อเจริญของราก ไมโครทิวบูลถูกมองเห็นได้โดยใช้การย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมี โครงสร้างไมโทซิส รวมถึงโซนโปรเฟส เส้นใย และแฟรกโมพลาสต์ ถูกนับจากภาพคอนโฟคอล ลูกศรชี้ไปที่โครงสร้างไมโครทิวบูลไมโทซิส เครื่องหมายดอกจันแสดงถึงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญกับการรักษาแบบหลอก (การทดสอบ t, p < 0.05)< 0.05) n>9. แถบมาตราส่วน = 50 ไมโครเมตร
แม้ว่า Ursa จะมีความสามารถในการรบกวนการทำงานของไมโครทิวบูล แต่กลไกการออกฤทธิ์ของมันคาดว่าจะแตกต่างจากสารที่ทำให้ไมโครทิวบูลสลายตัวโดยทั่วไป ตัวอย่างเช่น ความเข้มข้นสูงของสารที่ทำให้ไมโครทิวบูลสลายตัว เช่น ไดโซไพรไมด์และโอไรซาลิน จะกระตุ้นการขยายตัวแบบไม่สมมาตรของเซลล์ผิวหนัง ในขณะที่ KAND 11 ไม่เป็นเช่นนั้น นอกจากนี้ การใช้ KAND 11 ร่วมกับไดโซไพรไมด์ส่งผลให้เกิดการตอบสนองการเจริญเติบโตของรากที่เกิดจากไดโซไพรไมด์ร่วมกัน และพบการยับยั้งการเจริญเติบโตที่เกิดจาก KAND 11 (รูปที่ S4) เรายังวิเคราะห์การตอบสนองของกลายพันธุ์ไดโซไพรไมด์ 1-1 (phs1-1) ที่ไวต่อ KAND 11 มากเป็นพิเศษ phs1-1 มีการกลายพันธุ์แบบจุดของทูบูลินไคเนสที่ไม่เป็นไปตามแบบแผน และสร้างรากที่สั้นกว่าเมื่อได้รับการรักษาด้วยไดโซไพรไมด์9,20 ต้นกล้ากลายพันธุ์ phs1-1 ที่ปลูกบนอาหารเลี้ยงเชื้อวุ้นที่มี KAND 11 มีรากสั้นกว่า คล้ายกับต้นกล้าที่ปลูกบนอาหารเลี้ยงเชื้อรูปทรงพีระมิดคู่ (รูปที่ S5)
นอกจากนี้ เรายังสังเกตเห็นโครงสร้างไมโครทิวบูลในระยะไมโทซิส เช่น โซนโปรเฟส เส้นใยสปินเดิล และแฟรกโมพลาสต์ ในเนื้อเยื่อเจริญของรากต้นกล้าที่ได้รับการรักษาด้วย KAND 11 ซึ่งสอดคล้องกับการสังเกตสำหรับ CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS พบว่าจำนวนไมโครทิวบูลในระยะไมโทซิสลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 6c)
เพื่อศึกษาลักษณะความเป็นพิษต่อเซลล์ของ KAND 11 ในระดับเซลล์ย่อย เราได้ทำการทดลองโดยให้เซลล์แขวนลอยยาสูบ BY-2 ได้รับ KAND 11 และสังเกตการตอบสนองของเซลล์ โดยเริ่มจากการเติม KAND 11 ลงในเซลล์ BY-2 ที่แสดงออก TagRFP-TUA6 ซึ่งเป็นสารเรืองแสงที่ติดฉลากไมโครทิวบูล เพื่อประเมินผลของ KAND 11 ต่อไมโครทิวบูลบริเวณเยื่อหุ้มเซลล์ ความหนาแน่นของไมโครทิวบูลบริเวณเยื่อหุ้มเซลล์ถูกประเมินโดยใช้การวิเคราะห์ภาพ ซึ่งวัดเปอร์เซ็นต์ของพิกเซลโครงสร้างเซลล์เทียบกับพิกเซลไซโตพลาสซึม ผลการทดสอบแสดงให้เห็นว่า หลังจากให้เซลล์ได้รับ KAND 11 ที่ความเข้มข้น 50 μM หรือ 100 μM เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ความหนาแน่นลดลงอย่างมีนัยสำคัญเหลือ 0.94 ± 0.74% หรือ 0.23 ± 0.28% ตามลำดับ ในขณะที่ความหนาแน่นของเซลล์ที่ได้รับ DMSO มีค่าเท่ากับ 1.61 ± 0.34% (รูปที่ 7a) ผลลัพธ์เหล่านี้สอดคล้องกับการสังเกตใน Arabidopsis ที่พบว่าการรักษาด้วย KAND 11 ทำให้เกิดการสลายตัวของไมโครทิวบูลในคอร์เทกซ์ (รูปที่ 6b) เรายังได้ตรวจสอบสายพันธุ์ BY-2 ที่มีเส้นใยแอคตินที่ติดฉลาก GFP-ABD หลังจากได้รับการรักษาด้วย KAND 11 ในความเข้มข้นเดียวกัน และพบว่าการรักษาด้วย KAND 11 ทำให้เส้นใยแอคตินเสียหาย การรักษาด้วย KAND 11 ที่ความเข้มข้น 50 μM หรือ 100 μM เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ทำให้ความหนาแน่นของเส้นใยแอคตินลดลงอย่างมีนัยสำคัญเหลือ 1.20 ± 0.62% หรือ 0.61 ± 0.26% ตามลำดับ ในขณะที่ความหนาแน่นในเซลล์ที่ได้รับการรักษาด้วย DMSO อยู่ที่ 1.69 ± 0.51% (รูปที่ 2) 7b) ผลลัพธ์เหล่านี้แตกต่างจากผลของโพรพิซาไมด์ ซึ่งไม่มีผลต่อเส้นใยแอคติน และลาทรันคูลิน บี ซึ่งเป็นสารสลายแอคตินที่ไม่มีผลต่อไมโครทิวบูล (รูปที่ S6 ในข้อมูลเสริม) นอกจากนี้ การรักษาด้วยคูมาโมนาไมด์ 1, กรดคูมาโมนาไมด์ 6 หรือ KAND 11 ไม่ส่งผลกระทบต่อไมโครทิวบูลในเซลล์ HeLa (รูปที่ S7 ในข้อมูลเสริม) ดังนั้น จึงเชื่อว่ากลไกการออกฤทธิ์ของ KAND 11 แตกต่างจากสารรบกวนโครงสร้างเซลล์ที่รู้จักกันทั่วไป นอกจากนี้ การสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์ของเซลล์ BY-2 ที่ได้รับการรักษาด้วย KAND 11 เผยให้เห็นการเริ่มตายของเซลล์ในระหว่างการรักษาด้วย KAND 11 และแสดงให้เห็นว่าสัดส่วนของเซลล์ที่ตายแล้วซึ่งย้อมด้วยสีอีแวนส์บลูไม่ได้เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังจาก 30 นาทีของการรักษาด้วย KAND 11 ในขณะที่หลังจาก 90 นาทีของการรักษาด้วย KAND ที่ความเข้มข้น 50 μM หรือ 100 μM จำนวนเซลล์ที่ตายแล้วเพิ่มขึ้นเป็น 43.7% หรือ 80.1% ตามลำดับ (รูปที่ 7c) โดยสรุปแล้ว ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่าอนุพันธ์ของกรดเออร์โซลิกชนิดใหม่ KAND 11 เป็นสารยับยั้งโครงสร้างเซลล์เฉพาะพืชที่มีกลไกการออกฤทธิ์ที่ไม่เคยรู้จักมาก่อน
KAND มีผลต่อไมโครทิวบูลในคอร์เทกซ์ เส้นใยแอคติน และความมีชีวิตของเซลล์ยาสูบ BY-2 (a) การแสดงภาพไมโครทิวบูลในคอร์เทกซ์ของเซลล์ BY-2 ใน présence ของ TagRFP-TUA6 เซลล์ BY-2 ที่ได้รับการรักษาด้วย KAND 11 (50 μM หรือ 100 μM) หรือ DMSO ถูกตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล ความหนาแน่นของไมโครทิวบูลในคอร์เทกซ์คำนวณจากภาพจุลภาคของเซลล์อิสระ 25 เซลล์ ตัวอักษรแสดงถึงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (การทดสอบ Tukey HSD, p < 0.05)< 0.05) แถบมาตราส่วน = 10 µm (b) เส้นใยแอคตินในคอร์เทกซ์ของเซลล์ BY-2 ที่มองเห็นได้เมื่อมี GFP-ABD2 เซลล์ BY-2 ที่ได้รับการรักษาด้วย KAND 11 (50 μM หรือ 100 μM) หรือ DMSO ถูกตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล ความหนาแน่นของเส้นใยแอคตินในคอร์เทกซ์คำนวณจากภาพจุลภาคของเซลล์อิสระ 25 เซลล์ ตัวอักษรแสดงถึงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (การทดสอบ Tukey HSD, p < 0.05)< 0.05) แถบมาตราส่วน = 10 µm (c) การสังเกตเซลล์ BY-2 ที่ตายแล้วโดยการย้อมสี Evans blue เซลล์ BY-2 ที่ได้รับการรักษาด้วย KAND 11 (50 μM หรือ 100 μM) หรือ DMSO ถูกตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบส่องสว่าง n=3 แถบมาตราส่วน = 100 µm
การค้นพบและการประยุกต์ใช้ผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติใหม่ๆ นำไปสู่ความก้าวหน้าอย่างมากในด้านต่างๆ ของชีวิตมนุษย์ รวมถึงการแพทย์และการเกษตร การวิจัยในอดีตได้ดำเนินการเพื่อค้นหาสารประกอบที่มีประโยชน์จากทรัพยากรธรรมชาติ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง แอคติโนมัยซีสเป็นที่รู้จักกันดีว่ามีประโยชน์ในฐานะยาปฏิชีวนะต้านปรสิตสำหรับไส้เดือนฝอย เนื่องจากความสามารถในการผลิตเมตาโบไลต์ทุติยภูมิหลายชนิด เช่น อะเวอร์เมกติน ซึ่งเป็นสารประกอบหลักของไอเวอร์เมกติน และบลีโอไมซินและอนุพันธ์ของมัน ซึ่งใช้เป็นยาต้านมะเร็ง21,22 ในทำนองเดียวกัน สารประกอบกำจัดวัชพืชหลายชนิดได้รับการค้นพบจากแอคติโนมัยซีส ซึ่งบางชนิดได้ถูกนำมาใช้ในเชิงพาณิชย์แล้ว1,23 ดังนั้น การวิเคราะห์เมตาโบไลต์ของแอคติโนมัยซีสเพื่อแยกผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพที่ต้องการจึงถือเป็นกลยุทธ์ที่มีประสิทธิภาพ ในการศึกษาครั้งนี้ เราได้ค้นพบสารประกอบใหม่ คือ คูมาโมนาไมด์ จาก S. werraensis และสังเคราะห์มันได้สำเร็จ กรดเออร์โซนิกเป็นสารตัวกลางในการสังเคราะห์เออร์เบนาไมด์และอนุพันธ์ของมัน สารนี้สามารถทำให้รากม้วนงออย่างเป็นลักษณะเฉพาะ แสดงฤทธิ์กำจัดวัชพืชระดับปานกลางถึงรุนแรง และทำลายไมโครทูบูลของพืชโดยตรงหรือโดยอ้อม อย่างไรก็ตาม กลไกการออกฤทธิ์ของกรดเออร์โมโทนิกอาจแตกต่างจากสารยับยั้งไมโครทูบูลที่มีอยู่ เนื่องจาก KAND 11 ยังรบกวนเส้นใยแอคตินและทำให้เซลล์ตาย ซึ่งบ่งชี้ถึงกลไกการควบคุมที่กรดเออร์โมโทนิกและอนุพันธ์ของมันมีอิทธิพลต่อโครงสร้างโครงร่างเซลล์ที่หลากหลาย
การศึกษาลักษณะเฉพาะของกรดเออร์เบโนนิกอย่างละเอียดเพิ่มเติมจะช่วยให้เข้าใจกลไกการออกฤทธิ์ของกรดเออร์เบโนนิกได้ดียิ่งขึ้น โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เป้าหมายต่อไปคือการประเมินความสามารถของกรดเออร์โซนิกในการจับกับไมโครทูบูลที่ลดลง เพื่อตรวจสอบว่ากรดเออร์โซนิกและอนุพันธ์ของมันออกฤทธิ์โดยตรงต่อไมโครทูบูลและทำให้ไมโครทูบูลสลายตัวหรือไม่ หรือว่าการออกฤทธิ์ของมันส่งผลให้ไมโครทูบูลไม่เสถียร นอกจากนี้ ในกรณีที่ไมโครทูบูลไม่ใช่เป้าหมายโดยตรง การระบุตำแหน่งการออกฤทธิ์และเป้าหมายระดับโมเลกุลของกรดเออร์โซนิกในเซลล์พืชจะช่วยให้เข้าใจคุณสมบัติของสารประกอบที่เกี่ยวข้องและวิธีการปรับปรุงฤทธิ์ในการกำจัดวัชพืชได้ดียิ่งขึ้น การทดสอบฤทธิ์ทางชีวภาพของเราเผยให้เห็นความสามารถในการทำลายเซลล์พืชอย่างเฉพาะเจาะจงของกรดเออร์โซนิกต่อการเจริญเติบโตของพืช เช่น อาราบิโดปซิส ทาเลียนา ยาสูบ และลิเวอร์เวิร์ต ในขณะที่เซลล์ E. coli และ HeLa ไม่ได้รับผลกระทบ ความเป็นพิษต่อเซลล์สัตว์น้อยหรือไม่มีเลยเป็นข้อดีของอนุพันธ์ของกรดเออร์โซนิกหากนำไปพัฒนาเป็นสารกำจัดวัชพืชสำหรับใช้ในพื้นที่เกษตรกรรมแบบเปิด อันที่จริง เนื่องจากไมโครทูบูลเป็นโครงสร้างทั่วไปในยูคาริโอต การยับยั้งแบบเลือกเฉพาะในพืชจึงเป็นข้อกำหนดสำคัญสำหรับสารกำจัดวัชพืช ตัวอย่างเช่น โพรพิซาไมด์ ซึ่งเป็นสารสลายไมโครทูบูลที่จับกับทูบูลินโดยตรงและยับยั้งการสร้างพอลิเมอร์ ถูกนำมาใช้เป็นสารกำจัดวัชพืชเนื่องจากมีความเป็นพิษต่อเซลล์สัตว์ต่ำ24 ในทางตรงกันข้ามกับไดโซไพราไมด์ เบนซาไมด์ที่เกี่ยวข้องมีเป้าหมายเฉพาะที่แตกต่างกัน นอกจากไมโครทูบูลของพืชแล้ว RH-4032 หรือเบนโซแซไมด์ยังยับยั้งไมโครทูบูลของเซลล์สัตว์หรือโอโอไมซีตตามลำดับ และซาลิลาไมด์ถูกใช้เป็นสารฆ่าเชื้อราเนื่องจากมีความเป็นพิษต่อพืชต่ำ25,26,27 แบร์ที่ค้นพบใหม่และอนุพันธ์ของมันแสดงความเป็นพิษต่อเซลล์พืชแบบเลือกเฉพาะ แต่ควรสังเกตว่าการดัดแปลงเพิ่มเติมอาจเปลี่ยนแปลงเป้าหมายเฉพาะของพวกมัน ซึ่งอาจทำให้ได้อนุพันธ์เพิ่มเติมสำหรับการควบคุมเชื้อราก่อโรคหรือโอโอไมซีต
คุณสมบัติเฉพาะของกรดเออร์เบโนนิกและอนุพันธ์ของมันมีประโยชน์สำหรับการพัฒนาเป็นสารกำจัดวัชพืชและการใช้เป็นเครื่องมือวิจัย ความสำคัญของโครงสร้างไซโตสเกเลตันในการควบคุมรูปร่างของเซลล์พืชเป็นที่ยอมรับกันอย่างกว้างขวาง การศึกษาในอดีตแสดงให้เห็นว่าพืชได้พัฒนากลไกที่ซับซ้อนของการจัดระเบียบไมโครทิวบูลในคอร์เทกซ์โดยการควบคุมพลวัตของไมโครทิวบูลเพื่อควบคุมการสร้างรูปร่างอย่างเหมาะสม มีการระบุโมเลกุลจำนวนมากที่รับผิดชอบในการควบคุมกิจกรรมของไมโครทิวบูล และการวิจัยที่เกี่ยวข้องยังคงดำเนินต่อไป3,4,28 ความเข้าใจในปัจจุบันของเราเกี่ยวกับพลวัตของไมโครทิวบูลในเซลล์พืชยังไม่สามารถอธิบายกลไกของการจัดระเบียบไมโครทิวบูลในคอร์เทกซ์ได้อย่างสมบูรณ์ ตัวอย่างเช่น แม้ว่าทั้งดิโซไพรไมด์และโอไรซาลินสามารถทำให้ไมโครทิวบูลสลายตัวได้ แต่ดิโซไพรไมด์ทำให้รากผิดรูปอย่างรุนแรงในขณะที่โอไรซาลินมีผลกระทบเพียงเล็กน้อย นอกจากนี้ การกลายพันธุ์ในทูบูลินซึ่งทำให้ไมโครทิวบูลคงตัวยังทำให้รากหมุนไปทางขวา ในขณะที่แพคลิแทกเซลซึ่งทำให้พลวัตของไมโครทิวบูลคงตัวเช่นกันกลับไม่ทำให้เกิดการหมุนไปทางขวา ดังนั้น การศึกษาและระบุเป้าหมายระดับโมเลกุลของกรดเออร์โซลิกจึงน่าจะให้ข้อมูลเชิงลึกใหม่เกี่ยวกับการควบคุมไมโครทิวบูลในเปลือกพืช ในทำนองเดียวกัน การเปรียบเทียบสารเคมีที่มีประสิทธิภาพในการส่งเสริมการเจริญเติบโตที่ผิดปกติ เช่น ไดโซไพรไมด์ กับสารเคมีที่มีประสิทธิภาพน้อยกว่า เช่น โอไรซาลิน หรือกรดคูมาโมโตริก ในอนาคตจะให้เบาะแสว่าการเจริญเติบโตที่ผิดปกติเกิดขึ้นได้อย่างไร
ในทางกลับกัน การเปลี่ยนแปลงโครงสร้างไซโตสเกเลตันที่เกี่ยวข้องกับการป้องกันเป็นอีกหนึ่งความเป็นไปได้ที่จะอธิบายความเป็นพิษของกรดเออร์โซนิก การติดเชื้อของเชื้อโรคหรือการนำสารกระตุ้นเข้าสู่เซลล์พืชบางครั้งทำให้โครงสร้างไซโตสเกเลตันถูกทำลายและส่งผลให้เซลล์ตายในที่สุด29 ตัวอย่างเช่น มีรายงานว่าคริปโทแซนทินที่ได้จากโอโอไมซีตทำให้ไมโครทิวบูลและเส้นใยแอคตินแตกตัวก่อนที่เซลล์ยาสูบจะตาย คล้ายกับสิ่งที่เกิดขึ้นกับการรักษาด้วย KAND30,31 ความคล้ายคลึงกันระหว่างการตอบสนองการป้องกันและการตอบสนองของเซลล์ที่เกิดจากกรดเออร์โซนิกทำให้เราตั้งสมมติฐานว่าพวกมันกระตุ้นกระบวนการของเซลล์ที่เหมือนกัน แม้ว่าจะเห็นได้ชัดว่ากรดเออร์โซนิกมีผลเร็วกว่าและแรงกว่าคริปโทแซนทิน อย่างไรก็ตาม การศึกษาแสดงให้เห็นว่าการแตกตัวของเส้นใยแอคตินส่งเสริมการตายของเซลล์โดยธรรมชาติ ซึ่งไม่ได้เกิดขึ้นพร้อมกับการแตกตัวของไมโครทิวบูลเสมอไป29 นอกจากนี้ ยังต้องพิจารณาต่อไปว่าเชื้อโรคหรือสารกระตุ้นจะทำให้การเจริญเติบโตของรากผิดปกติหรือไม่ เช่นเดียวกับที่อนุพันธ์ของกรดเออร์โซนิกทำ ดังนั้น ความรู้ระดับโมเลกุลที่เชื่อมโยงการตอบสนองด้านการป้องกันและโครงสร้างเซลล์จึงเป็นปัญหาที่น่าสนใจที่ควรศึกษา การใช้ประโยชน์จากสารประกอบที่มีน้ำหนักโมเลกุลต่ำที่เกี่ยวข้องกับกรดเออร์โซนิก รวมถึงอนุพันธ์ต่างๆ ที่มีศักยภาพแตกต่างกัน อาจเปิดโอกาสในการกำหนดเป้าหมายกลไกของเซลล์ที่ไม่เป็นที่รู้จัก
โดยรวมแล้ว การค้นพบและการประยุกต์ใช้สารประกอบใหม่ๆ ที่ปรับเปลี่ยนพลวัตของไมโครทิวบูล จะเป็นวิธีการที่มีประสิทธิภาพในการแก้ไขกลไกโมเลกุลที่ซับซ้อนซึ่งเป็นพื้นฐานของการกำหนดรูปร่างของเซลล์พืช ในบริบทนี้ สารประกอบที่พัฒนาขึ้นใหม่ล่าสุดอย่างกรดเออร์โมโทนิก ซึ่งมีผลต่อไมโครทิวบูลและเส้นใยแอคติน และกระตุ้นให้เกิดการตายของเซลล์ อาจเป็นโอกาสในการถอดรหัสความเชื่อมโยงระหว่างการควบคุมไมโครทิวบูลกับกลไกอื่นๆ เหล่านี้ ดังนั้น การวิเคราะห์ทางเคมีและชีวภาพโดยใช้กรดเออร์เบโนนิกจะช่วยให้เราเข้าใจกลไกการควบคุมระดับโมเลกุลที่ควบคุมโครงสร้างเซลล์ของพืชได้ดียิ่งขึ้น
นำเชื้อ S. werraensis MK493-CF1 ใส่ลงในขวด Erlenmeyer แบบมีแผ่นกั้นขนาด 500 มล. ที่บรรจุอาหารเลี้ยงเชื้อ 110 มล. ซึ่งประกอบด้วยกาแลคโตส 2% (w/v), เอสเซนส์เพสต์ 2% (w/v), แบคโตคอมโพซิชั่น - ถั่วเหลือง 1% (w/v) (Thermo Fisher Scientific, Inc.), สารสกัดจากข้าวโพด 0.5% (w/v) (KOGOSTCH Co., Ltd., ประเทศญี่ปุ่น), (NH4)2SO4 0.2% (w/v) และ CaCO3 0.2% ในน้ำปราศจากไอออน (pH 7.4 ก่อนการฆ่าเชื้อ) บ่มเพาะเชื้อบนเครื่องเขย่าแบบหมุน (180 รอบต่อนาที) ที่อุณหภูมิ 27°C เป็นเวลา 2 วัน ทำการเพาะเลี้ยงเพื่อการผลิตโดยการหมักแบบของแข็ง นำเชื้อเริ่มต้น (7 มล.) ถ่ายลงในขวด K-1 ขนาด 500 มล. ที่บรรจุอาหารเลี้ยงเชื้อ 40 กรัม ซึ่งประกอบด้วยข้าวบาร์เลย์บด 15 กรัม (บริษัท MUSO จำกัด ประเทศญี่ปุ่น) และน้ำปราศจากไอออน 25 กรัม (ไม่ได้ปรับค่า pH ก่อนการฆ่าเชื้อ) ทำการหมักที่อุณหภูมิ 30°C ในที่มืดเป็นเวลา 14 วัน สกัดสารจากการหมักด้วยเอทานอล 40 มล./ขวด แล้วนำไปปั่นเหวี่ยง (1500 g, 4°C, 10 นาที) นำสารละลายส่วนบน (60 มล.) มาสกัดด้วยส่วนผสมของเมทานอล 10% และเอทิลอะซิเตต ชั้นสารอินทรีย์ถูกระเหยภายใต้ความดันลดลงเพื่อให้ได้สารตกค้าง (59.5 มก.) ซึ่งนำไปแยกด้วย HPLC โดยใช้การชะแบบไล่ระดับ (0–10 นาที: 90%) บนคอลัมน์เฟสย้อนกลับ (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 มม. × ความยาว 250 มม.) H2O/CH3CN, 10–35 นาที: 90% H2O/CH3CN ถึง 70% H2O/CH3CN (แบบไล่ระดับ), 35–45 นาที: 90% H2O/EtOH, 45–155 นาที: 90% H2O/EtOH ถึง 100% EtOH (แบบไล่ระดับ), 155–200 นาที: 100% EtOH) ที่อัตราการไหล 1.5 มล./นาที ได้คูมาโมนาไมด์ (1, 36.0 มก.) ในรูปผงอสัณฐานสีขาว
คุมาโมโตอะไมด์(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t , J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ ค่าที่คำนวณได้: 141.0659, ค่าที่วัดได้: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1
เมล็ดพันธุ์โคลัมเบีย (Col-0) ได้รับจากศูนย์ทรัพยากรชีวภาพอะราบิโดปซิส (ABRC) โดยได้รับอนุญาตให้ใช้ในการวิจัย เมล็ดพันธุ์ Col-0 ได้รับการขยายพันธุ์และดูแลรักษาภายใต้สภาวะห้องปฏิบัติการของเรา และใช้เป็นต้นอะราบิโดปซิสสายพันธุ์ป่า เมล็ดพันธุ์อะราบิโดปซิสได้รับการฆ่าเชื้อที่ผิวและเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ Murashige and Skoog ความเข้มข้นครึ่งหนึ่งที่มีส่วนผสมของซูโครส 2% (Fujifilm Wako Pure Chemical), กรด 2-(4-morpholino)ethanesulfonic (MES) 0.05% (w/v) (Fujifilm Wako Pure Chemical) และวุ้น 1.5% (Fujifilm Wako Pure Chemical) ที่ pH 5.7 ที่อุณหภูมิ 23 °C และแสงคงที่ เมล็ดพันธุ์ของกลายพันธุ์ phs1-1 ได้รับจาก T. Hashimoto (สถาบันวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งนารา)
เมล็ดพันธุ์ยาสูบสายพันธุ์ SR-1 ได้รับจาก T. Hashimoto (สถาบันวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งนารา) และใช้เป็นต้นยาสูบสายพันธุ์ป่า เมล็ดพันธุ์ยาสูบได้รับการฆ่าเชื้อที่ผิวและแช่ในน้ำปราศจากเชื้อเป็นเวลาสามคืนเพื่อกระตุ้นการงอก จากนั้นจึงนำไปวางในสารละลายความเข้มข้นครึ่งหนึ่งที่มีส่วนผสมของซูโครส 2%, MES 0.05% (w/v) และเจลแลนกัม 0.8% (Fujifilm Wako Pure Chemical) ในอาหารเลี้ยงเชื้อ Murashige and Skoog ที่มี pH 5.7 และบ่มที่อุณหภูมิ 23°C ภายใต้แสงคงที่
สายพันธุ์ Tak-1 ได้รับจาก T. Kohchi (มหาวิทยาลัยเกียวโต) และใช้เป็นหน่วยทดลองมาตรฐานสำหรับการศึกษามอสส์เวิร์ต เจมม่าได้มาจากพืชที่เพาะเลี้ยงและฆ่าเชื้อแล้ว นำไปเพาะบนอาหารเลี้ยงเชื้อ Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) ที่มีส่วนผสมของซูโครส 1% และเจลแลนกัม 0.3% และบ่มที่อุณหภูมิ 23°C ภายใต้แสงสว่างต่อเนื่อง
เซลล์ยาสูบ BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) ได้รับจาก S. Hasezawa (มหาวิทยาลัยโตเกียว) เซลล์ BY-2 ถูกเจือจาง 95 เท่าในอาหารเลี้ยงเชื้อ Linsmeier and Skoog ที่ดัดแปลงแล้ว และเติม 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 32 ทุกสัปดาห์ สารละลายเซลล์ถูกผสมบนเครื่องเขย่าแบบหมุนที่ 130 รอบต่อนาที ที่อุณหภูมิ 27°C ในที่มืด ล้างเซลล์ด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อสดปริมาณ 10 เท่า และแขวนลอยใหม่ในอาหารเลี้ยงเชื้อเดิม เซลล์สายพันธุ์ BY-2 ที่ได้รับการดัดแปลงพันธุกรรมซึ่งแสดงออกอย่างเสถียรของเครื่องหมายไมโครทิวบูล TagRFP-TUA6 หรือเครื่องหมายเส้นใยแอคติน GFP-ABD2 ภายใต้โปรโมเตอร์ไวรัสโมเสกของกะหล่ำปลี 35S ถูกสร้างขึ้นตามที่อธิบายไว้33,34,35 เซลล์สายพันธุ์เหล่านี้สามารถบำรุงรักษาและซิงโครไนซ์ได้โดยใช้ขั้นตอนที่คล้ายกับที่ใช้สำหรับเซลล์สายพันธุ์ BY-2 ดั้งเดิม
เซลล์ HeLa ถูกเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเซลล์ Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies) เสริมด้วยซีรั่มจากลูกวัว 10%, เพนิซิลลิน 1.2 ยูนิต/มล. และสเตรปโตไมซิน 1.2 ไมโครกรัม/มล. ในตู้อบอุณหภูมิ 37°C ที่มี CO2 5%
การทดลองทั้งหมดที่อธิบายไว้ในเอกสารฉบับนี้ ดำเนินการตามข้อกำหนดและแนวทางด้านความปลอดภัยทางชีวภาพของประเทศญี่ปุ่น
สารประกอบต่างๆ ถูกละลายในไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) เป็นสารละลายตั้งต้น และเจือจางในอาหารเลี้ยงเชื้อ MS สำหรับอะราบิโดปซิสและยาสูบ หรืออาหารเลี้ยงเชื้อ Gamborg B5 สำหรับมอส สำหรับการทดสอบการยับยั้งการเจริญเติบโตของราก เมล็ดมากกว่า 10 เมล็ดต่อจานถูกเพาะบนอาหารวุ้นที่มีสารประกอบที่ระบุหรือ DMSO เมล็ดถูกบ่มในห้องเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 7 วัน ต้นกล้าถูกถ่ายภาพและวัดความยาวของราก สำหรับการทดสอบการงอกของอะราบิโดปซิส เมล็ด 48 เมล็ดต่อจานถูกเพาะบนอาหารวุ้นที่มีสารประกอบ 200 μM หรือ DMSO เมล็ดอะราบิโดปซิสถูกเลี้ยงในห้องเพาะเลี้ยงและนับจำนวนต้นกล้าที่งอก 7 วันหลังจากการงอก (dag) สำหรับการทดสอบการงอกของยาสูบ เมล็ด 24 เมล็ดต่อจานถูกเพาะบนอาหารวุ้นที่มี KAND 200 μM หรือ DMSO เมล็ดพันธุ์ยาสูบถูกนำไปเพาะในห้องเพาะเลี้ยง และนับจำนวนต้นกล้าที่งอกหลังจาก 14 วัน สำหรับการทดสอบการยับยั้งการเจริญเติบโตของมอส นำเอ็มบริโอ 9 ตัวจากแต่ละจานเพาะเลี้ยงไปเพาะบนอาหารวุ้นที่มีความเข้มข้นของ KAND หรือ DMSO ตามที่ระบุไว้ และบ่มในห้องเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 14 วัน
ใช้ต้นกล้าที่ย้อมด้วยโพรพิเดียมไอโอไดด์ (PI) ความเข้มข้น 5 มก./มล. เพื่อให้เห็นภาพโครงสร้างของเนื้อเยื่อเจริญปลายราก สัญญาณ PI ถูกสังเกตโดยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์โดยใช้กล้องจุลทรรศน์เลเซอร์สแกนนิ่งแบบคอนโฟคอล TCS SPE (Leica Microsystems)
การย้อมสีฮิสโตเคมีของรากด้วย β-กลูคูโรนิเดส (GUS) ดำเนินการตามโปรโตคอลที่อธิบายโดย Malami และ Benfey36 ต้นกล้าถูกตรึงในอะซิโตน 90% ค้างคืน ย้อมด้วย 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid 0.5 มก./มล. ในบัฟเฟอร์ GUS เป็นเวลา 1 ชั่วโมง และวางในสารละลายคลอรัลดีไฮด์ไฮเดรต (คลอรัลไฮเดรต 8 กรัม น้ำ 2 มล. และกลีเซอรอล 1 มล.) และสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบความแตกต่างของการรบกวนโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ Axio Imager M1 (Carl Zeiss)
วัดมุมรากของต้นกล้าอายุ 7 วันที่ปลูกบนจานวางในแนวตั้ง โดยวัดมุมของรากจากทิศทางของเวกเตอร์แรงโน้มถ่วงตามที่อธิบายไว้ในขั้นตอนที่ 6
การจัดเรียงของไมโครทูบูลในคอร์เทกซ์ได้รับการสังเกตตามที่อธิบายไว้ โดยมีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อยในโปรโตคอล 37 แอนติบอดีต่อ β-ทูบูลิน (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) และแอนติบอดีต่อเมาส์ IgG ที่ติดฉลากด้วย Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) ถูกใช้เป็นแอนติบอดีหลักและรองที่ความเจือจาง 1:1000 และ 1:100 ตามลำดับ ภาพเรืองแสงถูกบันทึกโดยใช้กล้องจุลทรรศน์เลเซอร์สแกนนิ่งแบบคอนโฟคอล TCS SPE (Leica Microsystems) บันทึกภาพ Z-stack และสร้างภาพฉายความเข้มสูงสุดตามคำแนะนำของผู้ผลิต
ทำการทดสอบการเพิ่มจำนวนเซลล์ HeLa โดยใช้ชุดตรวจนับเซลล์ Cell Counting Kit 8 (Dojindo) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต
วิเคราะห์การเจริญเติบโตของ E. coli DH5α โดยการวัดความหนาแน่นของเซลล์ในวัฒนธรรมโดยใช้สเปกโทรโฟโตมิเตอร์ที่ความยาวคลื่น 600 นาโนเมตร (OD600)
การจัดระเบียบโครงสร้างไซโตสเกเลตันในเซลล์ BY-2 ที่ได้รับการดัดแปลงพันธุกรรมนั้นสังเกตได้โดยใช้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ที่ติดตั้งอุปกรณ์สแกนคอนโฟคอล CSU-X1 (Yokogawa) และกล้อง sCMOS (Zyla, Andor Technology) ความหนาแน่นของไซโตสเกเลตันได้รับการประเมินโดยการวิเคราะห์ภาพ ซึ่งวัดปริมาณเปอร์เซ็นต์ของพิกเซลไซโตสเกเลตันในบรรดาพิกเซลไซโตพลาสซึมในภาพคอนโฟคอลโดยใช้ซอฟต์แวร์ ImageJ ตามที่อธิบายไว้38,39
เพื่อตรวจจับการตายของเซลล์ในเซลล์ BY-2 นำตัวอย่างเซลล์แขวนลอยไปบ่มกับสี Evans blue ความเข้มข้น 0.05% เป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง การย้อมสี Evans blue เฉพาะเซลล์ที่ตายแล้วขึ้นอยู่กับการขับสีออกจากเซลล์ที่มีชีวิตโดยเยื่อหุ้มเซลล์ที่สมบูรณ์40 สังเกตเซลล์ที่ย้อมสีแล้วโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบส่องสว่าง (BX53, Olympus)
เซลล์ HeLa ถูกเลี้ยงใน DMEM เสริมด้วย FBS 10% ในตู้อบที่มีความชื้นที่ 37°C และ CO2 5% เซลล์ได้รับการบำบัดด้วย KAND 11, กรดคูมาโมนามิก 6, คูมาโมนามิด 1, โคลเซมิด 100 ng/ml (Gibco) หรือโนโคดเมซ 100 ng/ml (Sigma) เป็นเวลา 6 ชั่วโมงที่ 37°C เซลล์ถูกตรึงด้วย MetOH เป็นเวลา 10 นาที แล้วตรึงด้วยอะซิเตทเป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้อง เซลล์ที่ถูกตรึงแล้วถูกบ่มด้วยแอนติบอดีหลัก β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) ที่เจือจางใน BSA 0.5%/PBS เป็นเวลา 2 ชั่วโมง ล้าง 3 ครั้งด้วย TBST แล้วบ่มด้วยแอนติบอดีแพะ Alexa Fluor 488 เป็นเวลา 1 ชั่วโมง – เมาส์ IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) และ 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ความเข้มข้น 15 ng/ml เจือจางใน 0.5% BSA/PBS หลังจากล้างด้วย TBST สามครั้ง เซลล์ที่ย้อมสีแล้วจะถูกสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบกลับหัว Nikon Eclipse Ti-E ภาพถูกบันทึกด้วยกล้อง CCD Hamamatsu ORCA-R2 แบบระบายความร้อน โดยใช้ซอฟต์แวร์ MetaMorph (Molecular Devices)