ขอขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature.com เวอร์ชันของเบราว์เซอร์ที่คุณใช้มีการรองรับ CSS แบบจำกัด สำหรับผลลัพธ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์เวอร์ชันใหม่กว่า (หรือปิดใช้งานโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) ในระหว่างนี้ เพื่อให้มั่นใจว่าจะได้รับการสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เราจึงแสดงเว็บไซต์โดยไม่ใช้รูปแบบหรือ JavaScript
การค้นพบและใช้ประโยชน์จากผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติสามารถช่วยปรับปรุงชีวิตมนุษย์ได้ สารเคมีที่ยับยั้งการเจริญเติบโตของพืชถูกใช้กันอย่างแพร่หลายเป็นสารกำจัดวัชพืชเพื่อควบคุมวัชพืช เนื่องจากมีความจำเป็นต้องใช้สารกำจัดวัชพืชประเภทต่างๆ จึงมีความจำเป็นต้องระบุสารประกอบที่มีกลไกการออกฤทธิ์ใหม่ ในการศึกษานี้ เราได้ค้นพบสารประกอบ N-alkoxypyrrole ชนิดใหม่ คือ coumamonamide จาก Streptomyces werraensis MK493-CF1 และสร้างกระบวนการสังเคราะห์ที่สมบูรณ์ จากการทดสอบกิจกรรมทางชีวภาพ เราได้ค้นพบว่ากรด urs-monoamic เป็นสารตัวกลางสังเคราะห์ของ urs-monoamide และมีศักยภาพสารยับยั้งการเจริญเติบโตของพืชนอกจากนี้ เราได้พัฒนาอนุพันธ์ของกรดเออร์เบนอนิกหลายชนิด รวมถึงอนุพันธ์ของกรดเออร์เบนิลออกซี (UDA) ซึ่งมีฤทธิ์กำจัดวัชพืชสูงโดยไม่ส่งผลเสียต่อการเจริญเติบโตของเซลล์ HeLa นอกจากนี้ เรายังพบว่าอนุพันธ์ของกรดเออร์โมโทนิกจะทำลายไมโครทูบูลของพืช นอกจากนี้ KAND ยังส่งผลต่อเส้นใยแอคตินและกระตุ้นให้เซลล์ตาย ผลกระทบหลายแง่มุมเหล่านี้แตกต่างจากสารยับยั้งไมโครทูบูลที่ทราบกันดี และชี้ให้เห็นกลไกการออกฤทธิ์ใหม่ของกรดเออร์โซนิก ซึ่งถือเป็นข้อได้เปรียบสำคัญในการพัฒนาสารกำจัดวัชพืชชนิดใหม่
การค้นพบและการนำผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติที่มีประโยชน์และอนุพันธ์ไปใช้ในทางปฏิบัติถือเป็นหนทางหนึ่งที่จะปรับปรุงคุณภาพชีวิตของมนุษย์ได้ เมแทบอไลต์รองที่ผลิตโดยจุลินทรีย์ พืช และแมลงทำให้เกิดความก้าวหน้าครั้งสำคัญในทางการแพทย์และการเกษตร ยาปฏิชีวนะและยาต้านมะเร็งเม็ดเลือดขาวหลายชนิดได้รับการพัฒนาจากผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติ นอกจากนี้ ยังมีสารออกฤทธิ์ประเภทต่างๆยาฆ่าแมลงสารป้องกันเชื้อราและสารกำจัดวัชพืชถูกสกัดออกมาจากผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติเหล่านี้เพื่อใช้ในภาคเกษตรกรรม โดยเฉพาะอย่างยิ่งสารกำจัดวัชพืชเป็นเครื่องมือสำคัญในการเพิ่มผลผลิตพืชผลในเกษตรกรรมสมัยใหม่ และมีการใช้สารประกอบประเภทต่างๆ ในเชิงพาณิชย์แล้ว กระบวนการในเซลล์หลายอย่างในพืช เช่น การสังเคราะห์แสง การเผาผลาญกรดอะมิโน การสังเคราะห์ผนังเซลล์ การควบคุมไมโทซิส การส่งสัญญาณของฮอร์โมนพืช หรือการสังเคราะห์โปรตีน ถือเป็นเป้าหมายทั่วไปของสารกำจัดวัชพืช สารประกอบที่ยับยั้งการทำงานของไมโครทูบูลเป็นกลุ่มสารกำจัดวัชพืชทั่วไปที่ส่งผลต่อการเจริญเติบโตของพืชโดยส่งผลต่อการควบคุมไมโทซิส2
ไมโครทูบูลเป็นส่วนประกอบของไซโทสเกเลตันและถูกอนุรักษ์ไว้อย่างกว้างขวางในเซลล์ยูคาริโอต เฮเทอโรไดเมอร์ทูบูลินประกอบด้วยอัลฟาทูบูลินและเบตาทูบูลินที่สร้างโปรโตฟิลาเมนต์ไมโครทูบูลเชิงเส้น โดยมีโปรโตฟิลาเมนต์ 13 โปรโตฟิลาเมนต์ที่สร้างโครงสร้างทรงกระบอก ไมโครทูบูลมีบทบาทหลายอย่างในเซลล์พืช รวมถึงการกำหนดรูปร่างของเซลล์ การแบ่งเซลล์ และการขนส่งภายในเซลล์3,4 เซลล์พืชมีไมโครทูบูลอยู่ใต้เยื่อหุ้มพลาสมาระหว่างเฟส และเชื่อว่าไมโครทูบูลคอร์เทกซ์เหล่านี้ควบคุมการจัดระเบียบของไมโครไฟบริลเซลลูโลสผ่านการควบคุมคอมเพล็กซ์เซลลูโลสซินเทส4,5 ไมโครทูบูลคอร์เทกซ์ของเซลล์เยื่อบุผิวราก ซึ่งอยู่ในโซนที่ปลายรากยืดออกอย่างรวดเร็ว จะอยู่ด้านข้าง และไมโครไฟบริลเซลลูโลสจะตามไมโครทูบูลเหล่านี้และจำกัดทิศทางการขยายตัวของเซลล์ จึงส่งเสริมการยืดตัวของเซลล์แบบแอนไอโซทรอปิก ดังนั้น การทำงานของไมโครทูบูลจึงมีความเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับสัณฐานวิทยาของพืช การแทนที่กรดอะมิโนในยีนที่เข้ารหัสทูบูลินทำให้ไมโครทูบูลอาร์เรย์ของเปลือกสมองเบี่ยงเบนไป และการเจริญเติบโตด้านซ้ายหรือด้านขวาใน Arabidopsis 6,7 ในทำนองเดียวกัน การกลายพันธุ์ในโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไมโครทูบูลซึ่งควบคุมพลวัตของไมโครทูบูลยังสามารถนำไปสู่การเจริญเติบโตของรากที่ผิดเพี้ยนได้8,9,10,11,12,13 นอกจากนี้ การบำบัดด้วยสารกำจัดวัชพืชที่รบกวนไมโครทูบูล เช่น ไดโซไพราไมด์ ซึ่งเรียกอีกอย่างว่าเพรทิลาคลอร์ ยังทำให้รากเอียงด้านซ้ายอีกด้วย14 ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่าการควบคุมการทำงานของไมโครทูบูลอย่างแม่นยำมีความสำคัญต่อการกำหนดทิศทางการเจริญเติบโตของพืช
สารยับยั้งไมโครทูบูลมีหลายประเภท และยาเหล่านี้มีส่วนสนับสนุนอย่างมากต่อการวิจัยโครงร่างเซลล์ ตลอดจนการเกษตรและการแพทย์2 โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ออริซาลิน สารประกอบไดไนโตรอะนิลีน ไดโซไพราไมด์ สารประกอบที่เกี่ยวข้องกับเบนซาไมด์ และสารประกอบแอนะล็อกของสารเหล่านี้สามารถยับยั้งการทำงานของไมโครทูบูลและยับยั้งการเจริญเติบโตของพืชได้ ดังนั้น จึงมีการใช้สารเหล่านี้กันอย่างแพร่หลายในฐานะสารกำจัดวัชพืช อย่างไรก็ตาม เนื่องจากไมโครทูบูลเป็นองค์ประกอบที่สำคัญของเซลล์พืชและสัตว์ สารยับยั้งไมโครทูบูลส่วนใหญ่จึงเป็นพิษต่อเซลล์ทั้งสองประเภท ดังนั้น แม้ว่าจะได้รับการยอมรับว่ามีประโยชน์ในฐานะสารกำจัดวัชพืช แต่สารต้านไมโครทูบูลจำนวนจำกัดก็ถูกนำมาใช้เพื่อจุดประสงค์ในทางปฏิบัติ
Streptomyces เป็นสกุลหนึ่งในตระกูล Streptomyces ซึ่งรวมถึงแบคทีเรียแอโรบิก แบคทีเรียแกรมบวก แบคทีเรียเส้นใย และเป็นที่รู้จักกันอย่างแพร่หลายว่าสามารถผลิตเมตาบอไลต์รองได้หลากหลาย จึงถือเป็นหนึ่งในแหล่งที่สำคัญที่สุดของผลิตภัณฑ์ธรรมชาติที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพใหม่ ในการศึกษาปัจจุบัน เราค้นพบสารประกอบใหม่ที่เรียกว่าคูมาโมนาไมด์ ซึ่งแยกได้จาก Streptomyces werraensis MK493-CF1 และ S. werraensis ISP 5486 โดยใช้การวิเคราะห์สเปกตรัมและการวิเคราะห์สเปกตรัมเต็มรูปแบบ โครงสร้างของคูมาโมนาไมด์ได้รับการกำหนดลักษณะ และโครงกระดูก N-alkoxypyrrole ที่เป็นเอกลักษณ์ของมันได้รับการระบุ การสังเคราะห์ กรดเออร์โมโนนิก ซึ่งเป็นสารตัวกลางสังเคราะห์ของเออร์โมโนอะไมด์และอนุพันธ์ของมัน พบว่าสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตและการงอกของพืชต้นแบบยอดนิยม Arabidopsis thaliana จากการศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างกับกิจกรรม เราพบว่าสารประกอบที่มี C9 ดัดแปลงเป็นกรดเออร์โซนิก เรียกว่า อนุพันธ์โนนิลออกซีของกรดเออร์โซนิก (KAND) ช่วยเพิ่มผลการยับยั้งการเจริญเติบโตและการงอกได้อย่างมีนัยสำคัญ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง สารยับยั้งการเจริญเติบโตของพืชที่เพิ่งค้นพบใหม่ยังส่งผลต่อการเจริญเติบโตของยาสูบและลิเวอร์เวิร์ต และไม่เป็นพิษต่อแบคทีเรียหรือเซลล์ HeLa นอกจากนี้ อนุพันธ์ของกรดเออร์โซนิกบางชนิดยังกระตุ้นให้เกิดฟีโนไทป์ของรากที่ผิดเพี้ยน ซึ่งหมายความว่าอนุพันธ์เหล่านี้มีผลต่อไมโครทูบูลโดยตรงหรือโดยอ้อม สอดคล้องกับแนวคิดนี้ การสังเกตไมโครทูบูลที่ติดฉลากด้วยภูมิคุ้มกันหรือโปรตีนเรืองแสงของเราบ่งชี้ว่าการรักษาด้วย KAND จะทำให้ไมโครทูบูลสลายตัว นอกจากนี้ การรักษาด้วยอนุพันธ์ของกรดคุมะโมโตนิกยังทำลายไมโครฟิลาเมนต์แอคตินด้วย ดังนั้น เราจึงค้นพบสารยับยั้งการเจริญเติบโตของพืชชนิดใหม่ที่มีกลไกการออกฤทธิ์เฉพาะตัวที่เกี่ยวข้องกับการทำลายไซโทสเกเลตัน
สายพันธุ์ MK493-CF1 ถูกแยกจากดินในเขตชินากาวะ โตเกียว สายพันธุ์ MK493-CF1 ก่อตัวเป็นไมซีเลียมสโตรมัลที่มีกิ่งก้านสาขาดี ลำดับบางส่วนของยีน RNA ไรโบโซม 16S (1422 bp) ถูกกำหนด สายพันธุ์นี้มีความคล้ายคลึงกับ S. werraensis มาก (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: สายพันธุ์ทั่วไป 99.93%) จากผลนี้ พบว่าสายพันธุ์นี้มีความเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับสายพันธุ์ประเภทของ S. werraensis ดังนั้นเราจึงตั้งชื่อสายพันธุ์นี้ชั่วคราวว่า S. werraensis MK493-CF1 S. werraensis ISP 5486T ยังผลิตสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพชนิดเดียวกันอีกด้วย เนื่องจากมีการวิจัยในช่วงแรกเพียงเล็กน้อยเกี่ยวกับการได้รับผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติจากจุลินทรีย์ชนิดนี้ จึงได้มีการดำเนินการวิจัยทางเคมีเพิ่มเติม หลังจากเพาะเลี้ยง S. werraensis MK493-CF1 บนอาหารเลี้ยงเชื้อข้าวบาร์เลย์โดยการหมักแบบของแข็งที่อุณหภูมิ 30°C เป็นเวลา 14 วัน อาหารเลี้ยงเชื้อจะถูกสกัดด้วยเอทานอล 50% ตัวอย่าง 60 มล. ถูกทำให้แห้งเพื่อให้ได้สารสกัดดิบ 59.5 มก. สารสกัดดิบถูกทำให้แห้งด้วย HPLC แบบเฟสย้อนกลับเพื่อให้ได้ N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1 ชื่อว่า coumamonamide 36.0 มก.) ปริมาณรวมของ 1 คือประมาณ 60% ของสารสกัดดิบ ดังนั้นเราจึงตัดสินใจศึกษาคุณสมบัติของ kumamotoamide 1 อย่างละเอียด
Coumamonamide 1 เป็นผงอสัณฐานสีขาวและการตรวจด้วยแมสสเปกโตรเมทรีความละเอียดสูง (HRESIMS) ยืนยัน C6H8N2O2 (รูปที่ 1) เศษไพโรลที่ทดแทน C2 ของสารประกอบนี้มีลักษณะเฉพาะคือ δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH ในสเปกตรัม 1H NMR: 4.5 Hz, H-5) และ δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) และสเปกตรัม 13C NMR แสดงให้เห็นการมีอยู่ของอะตอมคาร์บอน sp2 สี่อะตอม การมีอยู่ของกลุ่มอะไมด์ที่ตำแหน่ง C2 ได้รับการประเมินโดยความสัมพันธ์ HMBC จากโปรตอน C-3 กับคาร์บอนอะไมด์คาร์บอนิลที่ δC 161.1 นอกจากนี้ จุดสูงสุดของ NMR 1 H และ 13 C ที่ δH 4.10 (3H, S) และ δC 68.3 บ่งชี้ถึงการมีอยู่ของกลุ่ม N-methoxy ในโมเลกุล แม้ว่าจะยังไม่ได้ระบุตำแหน่งที่ถูกต้องของกลุ่ม methoxy โดยใช้การวิเคราะห์สเปกโทรสโคปี เช่น สเปกโทรสโคปีความแตกต่างที่เพิ่มขึ้นและการย่อของ Nuclear Overhauser (NOEDF) แต่ N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide ก็กลายเป็นสารประกอบตัวเลือกแรก
การกำหนดโครงสร้างที่ถูกต้องของ 1 ได้ทำการสังเคราะห์ทั้งหมด (รูปที่ 2a) การบำบัด 2-aminopyridine 2 ที่มีจำหน่ายในท้องตลาดด้วย m-CPBA ส่งผลให้ได้ N-oxide 3 ที่สอดคล้องกันในผลผลิตเชิงปริมาณ หลังจาก 2-aminoazidation ของ 2 ปฏิกิริยาไซโคลคอนเดนเซชันที่อธิบายโดย Abramovich จะดำเนินการในเบนซินที่ 90°C เพื่อให้ได้ 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 ที่ต้องการในหน่วยกรัม ความเร็ว 60% (สองขั้นตอน) 15,16 จากนั้นเมทิลเลชันและไฮโดรไลซิสของ 4 จะให้ 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylic acid (เรียกว่า “cumotonic acid”, 6) ในผลผลิตที่ดี (70%, สองขั้นตอน) ในที่สุด การเติมอะมิดีนผ่านกรดคลอไรด์ตัวกลาง 6 โดยใช้แอมโมเนียในน้ำทำให้ได้อะมิดีน 1 ของ Kumamoto ในผลผลิต 98% ข้อมูลสเปกตรัมทั้งหมดของ 1 ที่สังเคราะห์มีความคล้ายคลึงกับ 1 ที่แยกกัน ดังนั้นจึงสามารถกำหนดโครงสร้างของ 1 ได้
การสังเคราะห์และการวิเคราะห์ทั่วไปของกิจกรรมทางชีวภาพของ urbenamide และกรด urbenic (ก) การสังเคราะห์ทั้งหมดของ Kumamoto amide (ข) ต้นกล้า Arabidopsis Columbia (Col) ชนิดป่าอายุ 7 วันปลูกบนแผ่น Murashige และ Skoog (MS) ที่มี coumamonamide 6 หรือ coumamonamide 1 ในความเข้มข้นที่ระบุ แถบมาตราส่วน = 1 ซม.
ขั้นแรก เราประเมินกิจกรรมทางชีวภาพของ urbenamide และสารตั้งต้นของสารนี้เพื่อดูความสามารถในการปรับการเจริญเติบโตของพืช เราเติม ursmonamide 1 หรือกรด ursmonic 6 ในความเข้มข้นต่างๆ ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ MS agar และเพาะต้นกล้า Arabidopsis thaliana บนอาหารเลี้ยงเชื้อนี้ การทดสอบเหล่านี้แสดงให้เห็นว่า 6 ในความเข้มข้นสูง (500 μM) ยับยั้งการเจริญเติบโตของราก (รูปที่ 2b) ต่อมา เราสร้างอนุพันธ์ต่างๆ โดยการแทนที่ตำแหน่ง N1 ของ 6 และทำการศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างกับกิจกรรมของอนุพันธ์เหล่านี้ (กระบวนการสังเคราะห์อะนาล็อกอธิบายไว้ในข้อมูลสนับสนุน (SI)) ต้นกล้า Arabidopsis ถูกปลูกบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีอนุพันธ์ของกรด ursonic 50 μM และวัดความยาวราก ตามที่แสดงในรูปภาพ ตามที่แสดงในรูปที่ 3a, b และ S1 กรดคูมาโมมีโซ่อัลคอกซีเชิงเส้น (9, 10, 11, 12 และ 13) หรือโซ่อัลคอกซีขนาดใหญ่ (15, 16 และ 17) ที่ตำแหน่ง N1 ที่มีความยาวต่างกัน อนุพันธ์แสดงการยับยั้งการเจริญเติบโตของรากอย่างมีนัยสำคัญ นอกจากนี้ เราพบว่าการใช้ 10, 11 หรือ 17 ความเข้มข้น 200 μM สามารถยับยั้งการงอกได้ (รูปที่ 3c และ S2)
การศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างและกิจกรรมของสารอะไมด์คุมาโมโตะและสารประกอบที่เกี่ยวข้อง (ก) โครงสร้างและโครงร่างการสังเคราะห์ของสารอนุพันธ์ (ข) การวัดปริมาณความยาวรากของต้นกล้าอายุ 7 วันที่ปลูกในอาหาร MS ที่มีหรือไม่มีอนุพันธ์คูมาโมนาไมด์ความเข้มข้น 50 μM เครื่องหมายดอกจันบ่งชี้ความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญกับการบำบัดแบบหลอก (การทดสอบ t, p< 0.05). น>18. ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน nt หมายถึง “ไม่ได้ทดสอบ” เนื่องจากเมล็ดมากกว่า 50% ไม่งอก (c) การวัดปริมาณอัตราการงอกของเมล็ดที่ผ่านการบำบัดแล้วซึ่งฟักเป็นเวลา 7 วันในอาหาร MS ที่มีหรือไม่มีคูมาโมนาไมด์ 200 μM และสารประกอบที่เกี่ยวข้อง เครื่องหมายดอกจันแสดงถึงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญกับการบำบัดแบบหลอก (การทดสอบไคสแควร์) n=96
ที่น่าสนใจคือ การเพิ่มหมู่ข้างของอัลคิลที่ยาวกว่า C9 จะทำให้กิจกรรมการยับยั้งลดลง ซึ่งบ่งบอกว่าสารประกอบที่เกี่ยวข้องกับกรดคุมะโมโตอิกจำเป็นต้องมีหมู่ข้างที่มีขนาดหนึ่งเพื่อแสดงกิจกรรมทางชีวภาพ
เนื่องจากการวิเคราะห์ความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างและกิจกรรมแสดงให้เห็นว่า C9 ถูกดัดแปลงเป็นกรดเออร์โซนิกและอนุพันธ์โนนิลออกซีของกรดเออร์โซนิก (ต่อไปนี้จะเรียกว่า KAND 11) เป็นสารยับยั้งการเจริญเติบโตของพืชที่มีประสิทธิภาพมากที่สุด เราจึงได้ดำเนินการจำแนกลักษณะ KAND 11 อย่างละเอียดมากขึ้น การบำบัด Arabidopsis ด้วย KAND 11 ความเข้มข้น 50 μM สามารถป้องกันการงอกได้เกือบสมบูรณ์ ในขณะที่ KAND 11 ความเข้มข้นที่ต่ำกว่า (40, 30, 20 หรือ 10 μM) สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของรากได้ในลักษณะที่ขึ้นอยู่กับปริมาณยา (รูปที่ 4a, b) เพื่อทดสอบว่า KAND 11 ส่งผลต่อความสามารถในการมีชีวิตของเนื้อเยื่อเจริญของรากหรือไม่ เราจึงตรวจสอบเนื้อเยื่อเจริญของรากที่ย้อมด้วยโพรพิดิอัมไอโอไดด์ (PI) และวัดขนาดพื้นที่เนื้อเยื่อเจริญ ขนาดของเนื้อเยื่อเจริญของต้นกล้าที่ปลูกในอาหารที่มี KAND-11 ความเข้มข้น 25 μM คือ 151.1 ± 32.5 μm ในขณะที่ขนาดของเนื้อเยื่อเจริญของต้นกล้าที่ปลูกในอาหารควบคุมที่มี DMSO คือ 264.7 ± 30.8 μm (รูปที่ 4c, d) ซึ่งบ่งชี้ว่า KAND-11 ฟื้นฟูการทำงานของเซลล์ การแพร่กระจายของเนื้อเยื่อเจริญของราก สอดคล้องกับสิ่งนี้ การบำบัดด้วย KAND 11 ลดปริมาณสัญญาณของเครื่องหมายการแบ่งเซลล์ CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS ในเนื้อเยื่อเจริญของราก (รูปที่ 4e) 17 ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า KAND 11 ยับยั้งการเจริญเติบโตของรากโดยลดกิจกรรมการแพร่กระจายของเซลล์
การวิเคราะห์ผลการยับยั้งการเจริญเติบโตของอนุพันธ์ของกรดเออร์เบโนนิก (อนุพันธ์ของกรดเออร์เบนิลอกซี) (ก) ต้นกล้าพันธุ์ป่า Col อายุ 7 วัน ที่ปลูกบนจาน MS ที่มีความเข้มข้นที่ระบุของ KAND 11 มาตราส่วน = 1 ซม. (ข) การวัดปริมาณความยาวราก ตัวอักษรแสดงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (การทดสอบ Tukey HSD, หน้า< 0.05). น>16. ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน (c) กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคัลของราก Col ชนิดป่าที่ย้อมด้วยโพรพิดิอัมไอโอไดด์ที่ปลูกบนแผ่น MS ที่มีหรือไม่มี KAND 11 ความเข้มข้น 25 μM วงเล็บสีขาวแสดงถึงเนื้อเยื่อเจริญของราก มาตราส่วน = 100 µm (d) การวัดปริมาณเนื้อเยื่อเจริญของราก (n = 10 ถึง 11) ความแตกต่างทางสถิติถูกกำหนดโดยใช้การทดสอบ t (p< 0.05) แถบแสดงขนาดเฉลี่ยของเนื้อเยื่อเจริญ (e) กล้องจุลทรรศน์แบบ Differential Interference Contrast (DIC) ของเนื้อเยื่อเจริญรากที่มีโครงสร้าง CDKB2; 1pro: CDKB2; ย้อม 1-GUS และย้อมบนต้นกล้าอายุ 5 วันที่ปลูกบนแผ่น MS ที่มีหรือไม่มีการใช้การทดสอบ KAND 25 µM
ความเป็นพิษต่อพืชของ KAND 11 ได้รับการทดสอบเพิ่มเติมโดยใช้พืชใบเลี้ยงคู่ชนิดอื่นคือยาสูบ (Nicotiana tabacum) และพืชจำลองที่สำคัญคือลิเวอร์เวิร์ต (Marchantia polymorpha) เช่นเดียวกับในกรณีของ Arabidopsis ต้นกล้ายาสูบ SR-1 ที่ปลูกในอาหารที่มี KAND 11 ความเข้มข้น 25 μM จะมีรากที่สั้นกว่า (รูปที่ 5a) นอกจากนี้ เมล็ดพันธุ์ 40 เมล็ดจาก 48 เมล็ดงอกบนจานที่มี KAND 11 ความเข้มข้น 200 μM ในขณะที่เมล็ดพันธุ์ทั้ง 48 เมล็ดงอกบนอาหารจำลอง ซึ่งบ่งชี้ว่าความเข้มข้นของ KAND ที่สูงขึ้นนั้นมีความสำคัญ (p< 0.05; การทดสอบไคสแควร์) ยับยั้งการงอกของยาสูบ (รูปที่ 5b) นอกจากนี้ ความเข้มข้นของ KAND 11 ที่ยับยั้งการเติบโตของแบคทีเรียในลิเวอร์เวิร์ตยังใกล้เคียงกับความเข้มข้นที่มีประสิทธิภาพใน Arabidopsis (รูปที่ 5c) ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า KAND 11 สามารถยับยั้งการเติบโตของพืชได้หลากหลายชนิด จากนั้น เราจึงตรวจสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เป็นไปได้ของสารประกอบที่เกี่ยวข้องกับโมโนเอไมด์ของหมีในสิ่งมีชีวิตอื่น ๆ เช่น เซลล์ HeLa ของมนุษย์และ Escherichia coli สายพันธุ์ DH5α ซึ่งเป็นตัวแทนของเซลล์สัตว์และแบคทีเรียระดับสูงตามลำดับ ในชุดการทดสอบการแพร่กระจายของเซลล์ เราสังเกตว่า coumamonamide 1, coumamonamidic acid 6 และ KAND 11 ไม่ส่งผลต่อการเติบโตของเซลล์ HeLa หรือ E. coli ที่ความเข้มข้น 100 μM (รูปที่ 5d,e)
การยับยั้งการเจริญเติบโตของ KAND 11 ในสิ่งมีชีวิตที่ไม่ใช่ Arabidopsis (a) ต้นกล้ายาสูบ SR-1 ชนิดป่าอายุ 2 สัปดาห์ปลูกบนแผ่น MS ที่วางในแนวตั้งซึ่งมี KAND 11 ความเข้มข้น 25 μM (b) ต้นกล้ายาสูบ SR-1 ชนิดป่าอายุ 2 สัปดาห์ปลูกบนแผ่น MS ที่วางในแนวนอนซึ่งมี KAND 11 ความเข้มข้น 200 μM (c) ช่อดอกลิเวอร์เวิร์ต Tak-1 ชนิดป่าอายุ 2 สัปดาห์ที่ปลูกบนแผ่น Gamborg B5 ที่มีความเข้มข้นของ KAND 11 ที่ระบุ ลูกศรสีแดงระบุสปอร์ที่หยุดเติบโตภายในระยะฟักตัว 2 สัปดาห์ (d) การทดสอบการแพร่พันธุ์ของเซลล์ HeLa จำนวนเซลล์ที่มีชีวิตวัดในช่วงเวลาที่กำหนดโดยใช้ชุดนับเซลล์ 8 (Dojindo) เพื่อเป็นการควบคุม เซลล์ HeLa ได้รับการบำบัดด้วยแอคติโนไมซินดี (Act D) ความเข้มข้น 5 μg/ml ซึ่งจะยับยั้งการถอดรหัสของ RNA polymerase และทำให้เซลล์ตาย การวิเคราะห์ดำเนินการซ้ำสามครั้ง (e) การทดสอบการแพร่กระจายของเซลล์ E. coli การวิเคราะห์การเติบโตของ E. coli โดยการวัด OD600 เพื่อเป็นการควบคุม เซลล์จะได้รับการบำบัดด้วยแอมพิซิลลิน 50 μg/ml (Amp) ซึ่งจะยับยั้งการสังเคราะห์ผนังเซลล์แบคทีเรีย การวิเคราะห์ดำเนินการซ้ำสามครั้ง
เพื่อถอดรหัสกลไกการทำงานของความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เกิดจากสารประกอบที่เกี่ยวข้องกับยูราไมด์ เราได้วิเคราะห์อนุพันธ์ของกรดเออร์เบนิกที่มีฤทธิ์ยับยั้งปานกลางอีกครั้ง ดังที่แสดงในรูปภาพ ดังที่แสดงในรูปที่ 2b, 6a ต้นกล้าที่ปลูกบนแผ่นวุ้นที่มีกรดเออร์โมโทนิก 6 ความเข้มข้นสูง (200 ไมโครโมลาร์) ผลิตรากที่สั้นกว่าและโค้งไปทางซ้าย (θ = – 23.7 ± 6.1) ในขณะที่ต้นกล้าที่ปลูกบนอาหารควบคุม ต้นกล้าผลิตรากที่เกือบตรง (θ = – 3.8 ± 7.1) การเจริญเติบโตแบบเอียงที่มีลักษณะเฉพาะนี้ทราบกันดีว่าเกิดจากความผิดปกติของไมโครทูบูลในเปลือกสมอง14,18 สอดคล้องกับการค้นพบนี้ ยาที่ทำลายไมโครทูบูลอย่างไดโซไพราไมด์และออริซาลินกระตุ้นให้รากเอียงในลักษณะเดียวกันภายใต้สภาวะการเจริญเติบโตของเรา (รูปที่ 2b, 6a) ในเวลาเดียวกัน เราได้ทดสอบอนุพันธ์ของกรดเออร์โมโทนิกและเลือกสารบางชนิดที่กระตุ้นการเจริญเติบโตของรากเอียงในความเข้มข้นบางอย่าง สารประกอบ 8, 9 และ 15 เปลี่ยนทิศทางการเจริญเติบโตของรากที่ 75 μM, 50 μM และ 40 μM ตามลำดับ ซึ่งบ่งชี้ว่าสารประกอบเหล่านี้สามารถทำให้ไมโครทูบูลไม่เสถียรได้อย่างมีประสิทธิภาพ (รูปที่ 2b, 6a) นอกจากนี้ เรายังทดสอบอนุพันธ์ของกรดเออร์โซลิกที่มีฤทธิ์แรงที่สุด คือ KAND 11 ที่ความเข้มข้นต่ำกว่า (15 µM) และพบว่าการใช้ KAND 11 ยับยั้งการเจริญเติบโตของราก และทิศทางการเจริญเติบโตของรากไม่สม่ำเสมอ แม้ว่าจะมีแนวโน้มเอียงไปทางซ้ายก็ตาม (รูปที่ C3) เนื่องจากยาที่ยับยั้งไมโครทูบูลในความเข้มข้นที่สูงขึ้นบางครั้งอาจยับยั้งการเจริญเติบโตของพืชแทนที่จะทำให้รากเอียง เราจึงประเมินความเป็นไปได้ที่ KAND 11 จะส่งผลต่อไมโครทูบูลโดยการสังเกตไมโครทูบูลในเปลือกเซลล์เยื่อบุผิวราก การตรวจภูมิคุ้มกันเนื้อเยื่อโดยใช้แอนติบอดีต่อเบตาทูบูลินในเซลล์ผิวหนังของรากต้นกล้าที่ได้รับการรักษาด้วย KAND 11 ความเข้มข้น 25 μM แสดงให้เห็นว่าไมโครทูบูลในเปลือกเซลล์เกือบทั้งหมดหายไปในเซลล์ผิวหนังในโซนการยืดออก (รูปที่ 6b) ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่ากรดคุมะโมโตนิกและอนุพันธ์ของกรดคุมะโมโตนิกออกฤทธิ์โดยตรงหรือโดยอ้อมต่อไมโครทูบูลเพื่อทำลายไมโครทูบูล และสารประกอบเหล่านี้เป็นสารยับยั้งไมโครทูบูลชนิดใหม่
กรดเออร์โซนิกและอนุพันธ์ของกรดดังกล่าวจะเปลี่ยนแปลงไมโครทูบูลในเปลือกสมองของ Arabidopsis thaliana (ก) มุมเอียงของรากที่วัดได้เมื่อมีอนุพันธ์ของกรดเออร์โซนิกต่างๆ ในความเข้มข้นที่ระบุ นอกจากนี้ ยังมีการวิเคราะห์ผลของสารประกอบ 2 ชนิดที่ทราบกันว่ายับยั้งไมโครทูบูล ได้แก่ ไดโซไพราไมด์และออริซาลิน ภาพที่แทรกแสดงมาตรฐานที่ใช้ในการวัดมุมการเจริญเติบโตของราก เครื่องหมายดอกจันบ่งชี้ความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญกับการรักษาแบบหลอก (การทดสอบ t, p< 0.05). น>19. มาตราส่วน = 1 ซม. (b) ไมโครทูบูลในเปลือกเซลล์ผิวหนังในบริเวณที่ยืดออก ไมโครทูบูลในราก Arabidopsis Col ชนิดป่าที่ปลูกบนจาน MS ที่มีหรือไม่มี KAND 11 25 μM สามารถมองเห็นได้โดยการย้อมสีภูมิคุ้มกันโดยใช้แอนติบอดีปฐมภูมิ β-ทูบูลินและแอนติบอดีทุติยภูมิที่จับคู่กับ Alexa Fluor มาตราส่วน = 10 µm (c) โครงสร้างไมโทซิสของไมโครทูบูลในเนื้อเยื่อเจริญราก ไมโครทูบูลสามารถมองเห็นได้โดยใช้การย้อมสีภูมิคุ้มกัน โครงสร้างไมโทซิส รวมทั้งโซนโปรเฟส สปินเดิล และแฟรกโมพลาสต์ ได้รับการนับจากภาพคอนโฟคัล ลูกศรแสดงโครงสร้างไมโครทูบูลในไมโทซิส เครื่องหมายดอกจันแสดงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญกับการรักษาหลอก (การทดสอบ t, p< 0.05). น>9. มาตราส่วน = 50 µm
แม้ว่า Ursa จะมีความสามารถในการขัดขวางการทำงานของไมโครทูบูล แต่กลไกการออกฤทธิ์คาดว่าจะแตกต่างจากสารสลายพอลิเมอไรเซชันของไมโครทูบูลทั่วไป ตัวอย่างเช่น สารสลายพอลิเมอไรเซชันของไมโครทูบูลที่มีความเข้มข้นสูงขึ้น เช่น ไดโซไพราไมด์และออริซาลิน จะกระตุ้นให้เซลล์เยื่อบุผิวขยายตัวแบบแอนไอโซทรอปิก ในขณะที่ KAND 11 ไม่สามารถทำได้ นอกจากนี้ การใช้ KAND 11 ร่วมกับไดโซไพราไมด์ยังส่งผลให้เกิดการตอบสนองการเจริญเติบโตของรากที่เกิดจากไดโซไพราไมด์ร่วมกัน และพบการยับยั้งการเจริญเติบโตที่เกิดจากไดโซไพราไมด์ (รูปที่ S4) นอกจากนี้ เรายังวิเคราะห์การตอบสนองของสารกลายพันธุ์ไดโซไพราไมด์ 1-1 (phs1-1) ที่ไวเกินปกติต่อ KAND 11 อีกด้วย phs1-1 มีจุดกลายพันธุ์ของทูบูลินไคเนสที่ไม่เป็นไปตามมาตรฐาน และผลิตรากที่สั้นกว่าเมื่อได้รับไดโซไพราไมด์9,20 ต้นกล้ากลายพันธุ์ phs1-1 ที่ปลูกในอาหารวุ้นที่มี KAND 11 จะมีรากสั้นกว่าเช่นเดียวกับต้นกล้าที่ปลูกบนไดโซพีระมิด (รูปที่ S5)
นอกจากนี้ เรายังได้สังเกตโครงสร้างไมโครทูบูลในไมโทซิส เช่น โซนโปรเฟส แกนด์ และแฟรกโมพลาสต์ ในเนื้อเยื่อเจริญรากของต้นกล้าที่ได้รับการรักษาด้วย KAND 11 ซึ่งสอดคล้องกับการสังเกต CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS พบว่าจำนวนไมโครทูบูลในไมโทซิสลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 6c)
เพื่อระบุลักษณะความเป็นพิษของ KAND 11 ในความละเอียดระดับเซลล์ย่อย เราได้ทำการบำบัดเซลล์แขวนลอย BY-2 ของยาสูบด้วย KAND 11 และสังเกตการตอบสนองของเซลล์เหล่านั้น ก่อนอื่น เราได้เติม KAND 11 ลงในเซลล์ BY-2 ที่แสดง TagRFP-TUA6 ซึ่งทำการติดฉลากไมโครทูบูลด้วยสารเรืองแสง เพื่อประเมินผลของ KAND 11 ต่อไมโครทูบูลในเปลือกสมอง จากนั้นจึงทำการประเมินความหนาแน่นของไมโครทูบูลในเปลือกสมองโดยใช้การวิเคราะห์ภาพ ซึ่งจะวัดเปอร์เซ็นต์ของพิกเซลโครงร่างเซลล์ในบรรดาพิกเซลของไซโทพลาสซึม ผลการทดสอบแสดงให้เห็นว่าหลังจากการบำบัดด้วย KAND 11 ความเข้มข้น 50 μM หรือ 100 μM เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ความหนาแน่นจะลดลงอย่างมีนัยสำคัญเหลือ 0.94 ± 0.74% หรือ 0.23 ± 0.28% ตามลำดับ ในขณะที่ความหนาแน่นของเซลล์ที่ได้รับการบำบัดด้วย DMSO มีค่าเท่ากับ 1.61 ± 0.34% (รูปที่ 7a) ผลลัพธ์เหล่านี้สอดคล้องกับการสังเกตใน Arabidopsis ที่ว่าการรักษาด้วย KAND 11 กระตุ้นการสลายตัวของไมโครทูบูลในเปลือกเซลล์ (รูปที่ 6b) นอกจากนี้ เรายังตรวจสอบสาย BY-2 ที่มีเส้นใยแอคตินที่ติดฉลากด้วย GFP-ABD หลังจากการรักษาด้วย KAND 11 ในความเข้มข้นเท่ากัน และพบว่าการรักษาด้วย KAND 11 ทำให้เส้นใยแอคตินถูกทำลาย การรักษาด้วย KAND 11 ความเข้มข้น 50 μM หรือ 100 μM เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ทำให้ความหนาแน่นของเส้นใยแอคตินลดลงอย่างมีนัยสำคัญเหลือ 1.20 ± 0.62% หรือ 0.61 ± 0.26% ตามลำดับ ในขณะที่ความหนาแน่นในเซลล์ที่ได้รับการรักษาด้วย DMSO อยู่ที่ 1.69 ± 0.51% (รูปที่ 2) 7b) ผลลัพธ์เหล่านี้แตกต่างกับผลของโพรพิซาไมด์ ซึ่งไม่มีผลต่อเส้นใยแอคติน และลาทรันคูลิน บี ซึ่งเป็นสารสลายตัวของแอคตินที่ไม่มีผลต่อไมโครทูบูล (SI รูปที่ S6) นอกจากนี้ การรักษาด้วย coumamonamide 1, coumamonamide acid 6 หรือ KAND 11 ไม่มีผลต่อไมโครทูบูลในเซลล์ HeLa (SI Figure S7) ดังนั้น เชื่อว่ากลไกการออกฤทธิ์ของ KAND 11 แตกต่างจากกลไกการออกฤทธิ์ของไซโทสเกเลตันที่ทราบกันดีอยู่แล้ว นอกจากนี้ การสังเกตเซลล์ BY-2 ที่ได้รับการรักษาด้วย KAND 11 ด้วยกล้องจุลทรรศน์เผยให้เห็นจุดเริ่มต้นของการตายของเซลล์ในระหว่างการรักษาด้วย KAND 11 และแสดงให้เห็นว่าสัดส่วนของเซลล์ที่ตายแล้วซึ่งย้อมด้วยสีน้ำเงิน Evans ไม่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังจากการรักษาด้วย KAND 11 เป็นเวลา 30 นาที ในขณะที่หลังจากการรักษาด้วย KAND 50 μM หรือ 100 μM เป็นเวลา 90 นาที จำนวนเซลล์ที่ตายแล้วเพิ่มขึ้นเป็น 43.7% หรือ 80.1% ตามลำดับ (รูปที่ 7c) เมื่อนำข้อมูลทั้งหมดมารวมกัน พบว่า KAND 11 ซึ่งเป็นอนุพันธ์ของกรดเออร์โซลิกชนิดใหม่นี้เป็นสารยับยั้งไซโทสเกเลตันเฉพาะในพืชที่มีกลไกการออกฤทธิ์ที่ยังไม่เป็นที่รู้จักมาก่อน
KAND ส่งผลต่อไมโครทูบูลในคอร์เทกซ์ เส้นใยแอคติน และความมีชีวิตของเซลล์ BY-2 ของยาสูบ (ก) การมองเห็นไมโครทูบูลในคอร์เทกซ์ในเซลล์ BY-2 ในการมีอยู่ของ TagRFP-TUA6 เซลล์ BY-2 ที่ได้รับการบำบัดด้วย KAND 11 (50 μM หรือ 100 μM) หรือ DMSO ได้รับการตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคัล ความหนาแน่นของไมโครทูบูลในคอร์เทกซ์คำนวณจากภาพถ่ายไมโครกราฟของเซลล์อิสระ 25 เซลล์ ตัวอักษรบ่งชี้ถึงความแตกต่างที่สำคัญ (การทดสอบ Tukey HSD, p< 0.05) มาตราส่วน = 10 µm (b) เส้นใยแอคตินในคอร์เทกซ์ในเซลล์ BY-2 ที่มองเห็นได้โดยมี GFP-ABD2 เซลล์ BY-2 ที่ได้รับการบำบัดด้วย KAND 11 (50 μM หรือ 100 μM) หรือ DMSO ได้รับการตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคัล ความหนาแน่นของเส้นใยแอคตินในคอร์เทกซ์คำนวณจากภาพถ่ายจุลภาคของเซลล์อิสระ 25 เซลล์ ตัวอักษรบ่งชี้ความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (การทดสอบ Tukey HSD, p< 0.05) มาตราส่วน = 10 µm (c) การสังเกตเซลล์ BY-2 ที่ตายแล้วโดยการย้อม Evans blue เซลล์ BY-2 ที่ได้รับการบำบัดด้วย KAND 11 (50 μM หรือ 100 μM) หรือ DMSO ได้รับการตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์สนามสว่าง n = 3 มาตราส่วน = 100 µm
การค้นพบและการประยุกต์ใช้ผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติชนิดใหม่ทำให้เกิดความก้าวหน้าอย่างมากในด้านต่างๆ ของชีวิตมนุษย์ รวมถึงการแพทย์และการเกษตร มีการทำการวิจัยทางประวัติศาสตร์เพื่อให้ได้สารประกอบที่มีประโยชน์จากทรัพยากรธรรมชาติ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง แอคติโนไมซีตเป็นที่ทราบกันว่ามีประโยชน์ในการเป็นยาปฏิชีวนะป้องกันปรสิตสำหรับไส้เดือนฝอย เนื่องจากแอคติโนไมซีตสามารถผลิตสารเมแทบอไลต์รองต่างๆ ได้ เช่น อะเวอร์เมกติน ซึ่งเป็นสารประกอบหลักของไอเวอร์เมกติน และเบลโอไมซินและอนุพันธ์ของสารนี้ ซึ่งใช้เป็นยาต้านมะเร็ง21,22 ในทำนองเดียวกัน แอคติโนไมซีตยังค้นพบสารกำจัดวัชพืชหลายชนิด ซึ่งบางชนิดมีการใช้ในเชิงพาณิชย์แล้ว1,23 ดังนั้น การวิเคราะห์เมแทบอไลต์ของแอคติโนไมซีตเพื่อแยกผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติที่มีกิจกรรมทางชีวภาพตามต้องการจึงถือเป็นกลยุทธ์ที่มีประสิทธิภาพ ในการศึกษานี้ เราค้นพบสารประกอบใหม่ คือ คูมาโมนาไมด์ จาก S. werraensis และสังเคราะห์สารประกอบดังกล่าวได้สำเร็จ กรดเออร์โซนิกเป็นสารตัวกลางสังเคราะห์ของเออร์เบนาไมด์และอนุพันธ์ของเออร์เบนาไมด์ กรดเออร์โมโทนิกสามารถทำให้รากม้วนงอได้ มีฤทธิ์กำจัดวัชพืชปานกลางถึงรุนแรง และทำลายไมโครทูบูลของพืชโดยตรงหรือโดยอ้อม อย่างไรก็ตาม กลไกการออกฤทธิ์ของกรดเออร์โมโทนิกอาจแตกต่างจากสารยับยั้งไมโครทูบูลที่มีอยู่ เนื่องจาก KAND 11 ยังทำลายเส้นใยแอคตินและทำให้เซลล์ตาย ซึ่งบ่งชี้ถึงกลไกการควบคุมที่กรดเออร์โมโทนิกและอนุพันธ์มีอิทธิพลต่อโครงสร้างโครงร่างเซลล์ในวงกว้าง
การจำแนกลักษณะกรดเออร์เบนอนิกอย่างละเอียดยิ่งขึ้นจะช่วยให้เข้าใจกลไกการทำงานของกรดเออร์เบนอนิกได้ดีขึ้น โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เป้าหมายต่อไปคือการประเมินความสามารถของกรดเออร์เบนอนิกในการจับกับไมโครทูบูลที่ลดลง เพื่อตรวจสอบว่ากรดเออร์เบนอนิกและอนุพันธ์ของกรดเออร์เบนอนิกทำปฏิกิริยากับไมโครทูบูลโดยตรงและทำให้ไมโครทูบูลสลายตัวหรือไม่ หรือการกระทำของกรดเออร์เบนอนิกจะส่งผลให้ไมโครทูบูลไม่เสถียรหรือไม่ นอกจากนี้ ในกรณีที่ไมโครทูบูลไม่ใช่เป้าหมายโดยตรง การระบุตำแหน่งที่ออกฤทธิ์และเป้าหมายระดับโมเลกุลของกรดเออร์เบนอนิกบนเซลล์พืชจะช่วยให้เข้าใจคุณสมบัติของสารประกอบที่เกี่ยวข้องและวิธีการที่เป็นไปได้ในการปรับปรุงกิจกรรมของสารกำจัดวัชพืชได้ดียิ่งขึ้น การทดสอบฤทธิ์ทางชีวภาพของเราเผยให้เห็นความสามารถเฉพาะตัวของกรดเออร์เบนอนิกในการก่อพิษต่อเซลล์ในการเจริญเติบโตของพืช เช่น Arabidopsis thaliana ยาสูบ และลิเวอร์เวิร์ต ในขณะที่เซลล์ E. coli และ HeLa ไม่ได้รับผลกระทบ ข้อได้เปรียบของอนุพันธ์ของกรดเออร์เบนอนิกคือความเป็นพิษต่อเซลล์สัตว์เพียงเล็กน้อยหรือไม่มีเลย หากได้รับการพัฒนาให้เป็นสารกำจัดวัชพืชสำหรับใช้ในทุ่งเกษตรแบบเปิด อันที่จริง เนื่องจากไมโครทูบูลเป็นโครงสร้างทั่วไปในยูคาริโอต การยับยั้งแบบเลือกสรรในพืชจึงมีความจำเป็นอย่างยิ่งสำหรับสารกำจัดวัชพืช ตัวอย่างเช่น โพรไพซาไมด์ ซึ่งเป็นสารสลายพอลิเมอไรเซชันของไมโครทูบูลที่จับกับทูบูลินโดยตรงและยับยั้งการเกิดพอลิเมอไรเซชัน ใช้เป็นสารกำจัดวัชพืชเนื่องจากมีความเป็นพิษต่อเซลล์สัตว์ต่ำ24 ต่างจากไดโซไพราไมด์ เบนซาไมด์ที่เกี่ยวข้องมีความจำเพาะต่อเป้าหมายที่แตกต่างกัน นอกจากไมโครทูบูลของพืชแล้ว RH-4032 หรือเบนโซซาไมด์ยังยับยั้งไมโครทูบูลของเซลล์สัตว์หรือโอโอไมซีตตามลำดับ และซาลิลาไมด์ใช้เป็นสารป้องกันเชื้อราเนื่องจากมีพิษต่อพืชต่ำ25,26,27 หมีที่เพิ่งค้นพบและอนุพันธ์ของมันแสดงพิษต่อเซลล์แบบเลือกสรรต่อพืช แต่ควรสังเกตว่าการดัดแปลงเพิ่มเติมอาจเปลี่ยนความจำเพาะต่อเป้าหมายของหมี ซึ่งอาจทำให้ได้อนุพันธ์เพิ่มเติมสำหรับการควบคุมเชื้อราหรือโอโอไมซีตที่ก่อโรค
คุณสมบัติเฉพาะตัวของกรดเออร์เบโนนิกและอนุพันธ์มีประโยชน์สำหรับการพัฒนาเป็นสารกำจัดวัชพืชและใช้เป็นเครื่องมือวิจัย ความสำคัญของไซโทสเกเลตันในการควบคุมรูปร่างเซลล์พืชเป็นที่ยอมรับกันอย่างกว้างขวาง จากการศึกษาในช่วงแรกพบว่าพืชได้พัฒนากลไกที่ซับซ้อนของการจัดระเบียบไมโครทูบูลในเปลือกสมองโดยควบคุมพลวัตของไมโครทูบูลเพื่อควบคุมการสร้างรูปร่างอย่างเหมาะสม มีการระบุโมเลกุลจำนวนมากที่รับผิดชอบต่อการควบคุมกิจกรรมของไมโครทูบูล และยังคงมีการวิจัยที่เกี่ยวข้องอยู่3,4,28 ความเข้าใจปัจจุบันของเราเกี่ยวกับพลวัตของไมโครทูบูลในเซลล์พืชไม่สามารถอธิบายกลไกของการจัดระเบียบไมโครทูบูลในเปลือกสมองได้อย่างครบถ้วน ตัวอย่างเช่น แม้ว่าทั้งไดโซไพราไมด์และออริซาลินจะสามารถสลายตัวของไมโครทูบูลได้ แต่ไดโซไพราไมด์ทำให้รากบิดเบี้ยวอย่างรุนแรง ในขณะที่ออริซาลินมีผลค่อนข้างน้อย นอกจากนี้ การกลายพันธุ์ในทูบูลิน ซึ่งทำให้ไมโครทูบูลมีเสถียรภาพ ยังทำให้เกิดการหมุนของรากแบบเดกซ์โทรโรเทชัน ในขณะที่แพกคลีแทกเซล ซึ่งทำให้พลวัตของไมโครทูบูลมีเสถียรภาพเช่นกัน ไม่เป็นเช่นนั้น ดังนั้น การศึกษาและระบุเป้าหมายโมเลกุลของกรดเออร์โซลิกควรให้ข้อมูลเชิงลึกใหม่ๆ เกี่ยวกับการควบคุมไมโครทูบูลในเปลือกสมองของพืช ในทำนองเดียวกัน การเปรียบเทียบในอนาคตระหว่างสารเคมีที่มีประสิทธิภาพในการส่งเสริมการเจริญเติบโตที่ผิดเพี้ยน เช่น ไดโซไพราไมด์ และสารเคมีที่มีประสิทธิภาพน้อยกว่า เช่น ออไรซาลินหรือกรดคูมามอเตอร์ริก จะให้เบาะแสว่าการเจริญเติบโตที่ผิดเพี้ยนเกิดขึ้นได้อย่างไร
ในทางกลับกัน การเปลี่ยนแปลงโครงสร้างเซลล์ที่เกี่ยวข้องกับการป้องกันเป็นอีกความเป็นไปได้ในการอธิบายความเป็นพิษของกรดเออร์โซนิก การติดเชื้อของเชื้อก่อโรคหรือการนำสารกระตุ้นเข้าไปในเซลล์พืชบางครั้งทำให้โครงสร้างเซลล์ถูกทำลายและเซลล์ตายในเวลาต่อมา29 ตัวอย่างเช่น มีรายงานว่าคริปโตแซนธินที่ได้จากโอไมซีตจะไปทำลายไมโครทูบูลและเส้นใยแอคตินก่อนที่เซลล์ยาสูบจะตาย ซึ่งคล้ายกับที่เกิดขึ้นกับการรักษาด้วย KAND30,31 ความคล้ายคลึงกันระหว่างการตอบสนองการป้องกันและการตอบสนองของเซลล์ที่เกิดจากกรดเออร์โซนิกทำให้เราตั้งสมมติฐานว่าการตอบสนองเหล่านี้จะกระตุ้นกระบวนการของเซลล์ทั่วไป แม้ว่ากรดเออร์โซนิกจะมีผลที่เร็วกว่าและรุนแรงกว่าคริปโตแซนธินก็ตาม อย่างไรก็ตาม การศึกษาได้แสดงให้เห็นว่าการหยุดชะงักของเส้นใยแอคตินจะส่งเสริมให้เซลล์ตายเอง ซึ่งไม่ได้มาพร้อมกับการหยุดชะงักของไมโครทูบูลเสมอไป29 นอกจากนี้ ยังต้องดูกันต่อไปว่าเชื้อก่อโรคหรือตัวกระตุ้นเป็นสาเหตุที่ทำให้รากเจริญเติบโตผิดรูปหรือไม่ เช่นเดียวกับอนุพันธ์ของกรดเออร์โซนิก ดังนั้น ความรู้เกี่ยวกับโมเลกุลที่เชื่อมโยงการตอบสนองการป้องกันและโครงร่างของเซลล์จึงเป็นปัญหาที่น่าสนใจที่จะต้องแก้ไข การใช้ประโยชน์จากสารประกอบที่มีน้ำหนักโมเลกุลต่ำที่เกี่ยวข้องกับกรดเออร์โซนิก รวมถึงอนุพันธ์ต่างๆ ที่มีศักยภาพแตกต่างกัน อาจช่วยให้สามารถกำหนดเป้าหมายกลไกของเซลล์ที่ไม่รู้จักได้
เมื่อนำมารวมกัน การค้นพบและการประยุกต์ใช้สารประกอบใหม่ที่ปรับเปลี่ยนพลวัตของไมโครทูบูลจะช่วยให้มีวิธีการที่มีประสิทธิภาพในการจัดการกับกลไกโมเลกุลที่ซับซ้อนซึ่งอยู่เบื้องหลังการกำหนดรูปร่างเซลล์ของพืช ในบริบทนี้ กรดเออร์โมโทนิกที่พัฒนาขึ้นใหม่ซึ่งมีผลต่อไมโครทูบูลและเส้นใยแอคติน และกระตุ้นให้เซลล์ตาย อาจเป็นโอกาสในการถอดรหัสความเชื่อมโยงระหว่างการควบคุมไมโครทูบูลและกลไกอื่นๆ เหล่านี้ ดังนั้น การวิเคราะห์ทางเคมีและชีวภาพโดยใช้กรดเออร์บีโนนิกจะช่วยให้เราเข้าใจกลไกการควบคุมโมเลกุลที่ควบคุมโครงร่างของเซลล์พืช
เพาะเชื้อ S. werraensis MK493-CF1 ลงในขวด Erlenmeyer แบบกั้นขนาด 500 มล. ที่บรรจุอาหารเพาะเมล็ด 110 มล. ประกอบด้วยกาแลกโตส 2% (w/v) สารสกัดเอสเซนเชียลออยล์ 2% (w/v) ส่วนผสม Bacto 1% (w/v) -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), สารสกัดข้าวโพด 0.5% (w/v) (KOGOSTCH Co., Ltd., ญี่ปุ่น), (NH4)2SO4 0.2% (w/v) และ CaCO3 0.2% ในน้ำดีไอออนไนซ์ (pH 7.4 ก่อนการทำให้ปราศจากเชื้อ) เพาะเชื้อในเครื่องเขย่าแบบหมุน (180 รอบต่อนาที) ที่อุณหภูมิ 27°C เป็นเวลา 2 วัน เพาะเลี้ยงเพื่อการผลิตโดยใช้การหมักในสภาวะของแข็ง ย้ายวัฒนธรรมเมล็ด (7 มล.) ลงในขวด K-1 ขนาด 500 มล. ที่บรรจุอาหารเลี้ยงเชื้อ 40 กรัม ซึ่งประกอบด้วยข้าวบาร์เลย์บด 15 กรัม (MUSO Co., Ltd., ญี่ปุ่น) และน้ำดีไอออนไนซ์ 25 กรัม (ไม่ได้ปรับ pH ก่อนการทำให้ปราศจากเชื้อ) การหมักดำเนินการที่อุณหภูมิ 30°C ในที่มืดเป็นเวลา 14 วัน วัสดุการหมักถูกสกัดด้วย EtOH 40 มล./ขวด แล้วปั่นเหวี่ยง (1,500 กรัม, 4°C, 10 นาที) สารสกัดจากวัฒนธรรม (60 มล.) ถูกสกัดด้วยส่วนผสมของ MeOH/EtOAc 10% ชั้นอินทรีย์ถูกระเหยภายใต้ความดันที่ลดลงเพื่อให้ได้สารตกค้าง (59.5 มก.) ซึ่งจะถูกทำให้เป็น HPLC ด้วยการชะแบบไล่ระดับ (0–10 นาที: 90%) ในคอลัมน์เฟสผันกลับ (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × ความยาว 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 นาที: 90% H2O/CH3CN ถึง 70% H2O/CH3CN (ไล่ระดับ) 35–45 นาที: 90% H2O/EtOH, 45–155 นาที: 90% H2O/EtOH ถึง 100% EtOH (ไล่ระดับ (ไล่ระดับ) 155–200 นาที: 100% EtOH) ที่อัตราการไหล 1.5 มล./นาที แยกคูมามอนาไมด์ (1, 36.0 มก.) ออกมาเป็นผงอสัณฐานสีขาว
คุมะโมะโตะเอไมด์(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t , J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ ค่าที่คำนวณได้: 141.0659, ค่าที่วัดได้: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1
เมล็ดพันธุ์โคลัมเบีย (Col-0) ได้รับจากศูนย์ทรัพยากรชีวภาพ Arabidopsis (ABRC) โดยได้รับอนุญาตให้ใช้ในการวิจัย เมล็ดพันธุ์ Col-0 ได้รับการขยายพันธุ์และบำรุงรักษาภายใต้สภาพห้องปฏิบัติการของเรา และใช้เป็นพืช Arabidopsis ชนิดป่า เมล็ดพันธุ์ Arabidopsis ได้รับการฆ่าเชื้อบนพื้นผิวและเพาะเลี้ยงในอาหาร Murashige และ Skoog ความเข้มข้นครึ่งหนึ่งที่มีซูโครส 2% (Fujifilm Wako Pure Chemical), กรด 2-(4-morpholino)ethanesulfonic (MES) 0.05% (w/v) (Fujifilm Wako Pure Chemical) และวุ้น 1.5% (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, ที่อุณหภูมิ 23 °C และแสงคงที่ เมล็ดพันธุ์ของกลายพันธุ์ phs1-1 ได้รับจาก T. Hashimoto (สถาบันวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีนารา)
เมล็ดพันธุ์สายพันธุ์ SR-1 ได้รับจาก T. Hashimoto (สถาบันวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีนารา) และใช้เป็นต้นยาสูบพันธุ์ป่า เมล็ดพันธุ์ยาสูบได้รับการฆ่าเชื้อบนพื้นผิวและแช่ในน้ำที่ผ่านการฆ่าเชื้อเป็นเวลาสามคืนเพื่อส่งเสริมการงอก จากนั้นนำไปใส่ในสารละลายความเข้มข้นครึ่งหนึ่งที่มีซูโครส 2% MES 0.05% (w/v) และเจลแลนกัม 0.8% (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. และ Skoog medium) ที่มีค่า pH 5.7 และฟักที่อุณหภูมิ 23°C ภายใต้แสงคงที่
T. Kohchi (มหาวิทยาลัยเกียวโต) เป็นผู้จัดหาสายพันธุ์ Tak-1 และใช้เป็นหน่วยทดลองมาตรฐานสำหรับการศึกษาลิเวอร์เวิร์ต Gemma ได้รับจากพืชที่เพาะเลี้ยงที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว จากนั้นเพาะในอาหาร Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) ที่มีซูโครส 1% และเจลแลนกัม 0.3% และฟักที่อุณหภูมิ 23°C ภายใต้แสงต่อเนื่อง
เซลล์ BY-2 ของยาสูบ (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) จัดทำโดย S. Hasezawa (University of Tokyo) เซลล์ BY-2 เจือจาง 95 เท่าในอาหารเลี้ยงเชื้อ Linsmeier และ Skoog ที่ดัดแปลงแล้ว และเสริมด้วยกรด 2,4-dichlorophenoxyacetic 32 ทุกสัปดาห์ เซลล์ที่แขวนลอยถูกผสมบนเครื่องเขย่าแบบหมุนที่ 130 รอบต่อนาที ที่อุณหภูมิ 27°C ในที่มืด ล้างเซลล์ด้วยปริมาตร 10 เท่าของอาหารเลี้ยงเชื้อสด แล้วแขวนลอยใหม่อีกครั้งในอาหารเลี้ยงเชื้อเดียวกัน เซลล์สายพันธุ์ทรานส์เจนิก BY-2 ที่แสดงเครื่องหมายไมโครทูบูล TagRFP-TUA6 หรือเครื่องหมายของเส้นใยแอคติน GFP-ABD2 อย่างเสถียรภายใต้โปรโมเตอร์ 35S ของไวรัสโมเสกกะหล่ำดอก ถูกสร้างขึ้นตามที่อธิบายไว้33,34,35 เซลล์สายพันธุ์เหล่านี้สามารถรักษาและซิงโครไนซ์ได้โดยใช้ขั้นตอนที่คล้ายกับที่ใช้กับเซลล์สายพันธุ์ BY-2 ดั้งเดิม
เซลล์ HeLa ได้รับการเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies) ที่เสริมด้วยซีรั่มโคทารก 10%, เพนิซิลลิน 1.2 U/ml และสเตรปโตมัยซิน 1.2 μg/ml ในตู้ฟักที่อุณหภูมิ 37°C ที่มี CO2 5%
การทดลองทั้งหมดที่อธิบายไว้ในต้นฉบับนี้ดำเนินการตามข้อบังคับและแนวทางด้านความปลอดภัยทางชีวภาพของญี่ปุ่น
สารประกอบถูกละลายในไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) เป็นสารละลายสต็อกและเจือจางในอาหาร MS สำหรับ Arabidopsis และยาสูบหรืออาหาร Gamborg B5 สำหรับลิเวอร์เวิร์ต สำหรับการทดสอบการยับยั้งการเจริญเติบโตของราก เมล็ดพันธุ์มากกว่า 10 เมล็ดต่อจานถูกหว่านบนอาหารวุ้นที่มีสารประกอบที่ระบุหรือ DMSO เมล็ดพันธุ์ถูกฟักในห้องเจริญเติบโตเป็นเวลา 7 วัน ถ่ายรูปต้นกล้าและวัดความยาวของราก สำหรับการทดสอบการงอกของ Arabidopsis เมล็ดพันธุ์ 48 เมล็ดต่อจานถูกหว่านบนอาหารวุ้นที่มีสารประกอบ 200 μM หรือ DMSO เมล็ด Arabidopsis ถูกปลูกในห้องเจริญเติบโตและนับจำนวนต้นกล้าที่งอก 7 วันหลังจากการงอก (dag) สำหรับการทดสอบการงอกของยาสูบ เมล็ดพันธุ์ 24 เมล็ดต่อจานถูกหว่านบนอาหารวุ้นที่มี KAND หรือ DMSO 200 μM เมล็ดยาสูบถูกปลูกในห้องเพาะเลี้ยง และนับจำนวนต้นกล้าที่งอกหลังจาก 14 วัน สำหรับการทดสอบการยับยั้งการเจริญเติบโตของลิเวอร์เวิร์ต เอ็มบริโอ 9 ตัวจากแต่ละจานจะถูกเพาะบนอาหารวุ้นที่มีความเข้มข้นที่ระบุของ KAND หรือ DMSO และฟักในห้องเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 14 วัน
ใช้ต้นกล้าที่ย้อมด้วยโพรพิดิอัมไอโอไดด์ (PI) 5 มก./มล. เพื่อดูโครงสร้างเนื้อเยื่อเจริญของราก สัญญาณ PI สังเกตได้จากกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์โดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบสแกนเลเซอร์คอนโฟคัล TCS SPE (Leica Microsystems)
การย้อมรากด้วยฮิสโตเคมีด้วย β-glucuronidase (GUS) ดำเนินการตามโปรโตคอลที่อธิบายโดย Malami และ Benfey36 ต้นกล้าถูกตรึงในอะซิโตน 90% ข้ามคืน ย้อมด้วย 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid 0.5 mg/ml ในบัฟเฟอร์ GUS เป็นเวลา 1 ชั่วโมง แล้ววางลงในสารละลายคลอเรลดีไฮด์ไฮด์ (คลอเรลไฮเดรต 8 กรัม น้ำ 2 มิลลิลิตร และกลีเซอรอล 1 มิลลิลิตร) และสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนทราสต์แบบอินเตอร์เฟอเรนซ์แบบต่าง ๆ โดยใช้กล้องจุลทรรศน์ Axio Imager M1 (Carl Zeiss)
วัดมุมรากของต้นกล้าอายุ 7 วันที่ปลูกบนจานที่จัดวางในแนวตั้ง วัดมุมรากจากทิศทางของเวกเตอร์แรงโน้มถ่วงตามที่อธิบายไว้ในขั้นตอนที่ 6
การจัดเรียงของไมโครทูบูลในเปลือกสมองได้รับการสังเกตตามที่อธิบายไว้ โดยมีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อยในโปรโตคอล 37 แอนติบอดีต่อ β-ทูบูลิน (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) และแอนติบอดี IgG ของเมาส์ที่จับคู่กับ Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) ถูกใช้เป็นแอนติบอดีหลักและรองที่การเจือจาง 1:1000 และ 1:100 ตามลำดับ ภาพเรืองแสงได้รับโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบเลเซอร์สแกนคอนโฟคัล TCS SPE (Leica Microsystems) รับภาพ Z-stack และสร้างการฉายภาพที่มีความเข้มข้นสูงสุดตามคำแนะนำของผู้ผลิต
การทดสอบการแพร่กระจายเซลล์ HeLa ดำเนินการโดยใช้ Cell Counting Kit 8 (Dojindo) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต
การเจริญเติบโตของ E. coli DH5α ได้รับการวิเคราะห์โดยการวัดความหนาแน่นของเซลล์ในวัฒนธรรมโดยใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ที่ 600 นาโนเมตร (OD600)
การจัดระเบียบโครงร่างเซลล์ในเซลล์ BY-2 ทรานส์เจนิกสังเกตได้โดยใช้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ที่ติดตั้งอุปกรณ์สแกนคอนโฟคัล CSU-X1 (Yokogawa) และกล้อง sCMOS (Zyla, Andor Technology) ความหนาแน่นของโครงร่างเซลล์ได้รับการประเมินโดยการวิเคราะห์ภาพ ซึ่งวัดเปอร์เซ็นต์ของพิกเซลโครงร่างเซลล์ท่ามกลางพิกเซลของไซโตพลาสซึมในภาพคอนโฟคัลโดยใช้ซอฟต์แวร์ ImageJ ตามที่อธิบายไว้38,39
เพื่อตรวจจับการตายของเซลล์ในเซลล์ BY-2 เซลล์ที่แขวนลอยบางส่วนจะถูกฟักกับ Evans blue 0.05% เป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง การย้อม Evans blue แบบเลือกเซลล์ที่ตายแล้วขึ้นอยู่กับการขับสีออกจากเซลล์ที่มีชีวิตโดยเยื่อหุ้มพลาสมาที่ยังคงสภาพเดิม40 เซลล์ที่ถูกย้อมจะถูกสังเกตโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบสนามสว่าง (BX53, Olympus)
เซลล์ HeLa ถูกเพาะเลี้ยงใน DMEM ที่เสริมด้วย FBS 10% ในตู้ฟักที่มีความชื้นที่อุณหภูมิ 37°C และ CO2 5% เซลล์ได้รับการบำบัดด้วย KAND 11 100 μM, กรด kumamonamic 6, kumamonamide 1, colcemid 100 ng/ml (Gibco) หรือ Nocodmaze 100 ng/ml (Sigma) เป็นเวลา 6 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37°C เซลล์ถูกตรึงด้วย MetOH เป็นเวลา 10 นาที จากนั้นด้วยอะซิเตทเป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้อง เซลล์ที่ถูกตรึงถูกบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิ β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) เจือจางใน 0.5% BSA/PBS เป็นเวลา 2 ชั่วโมง ล้างด้วย TBST 3 ครั้ง จากนั้นบ่มด้วยแอนติบอดีแพะ Alexa Fluor 488 1 ชั่วโมง – Mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) และ 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 15 ng/ml เจือจางใน BSA/PBS 0.5% หลังจากล้างด้วย TBST สามครั้ง เซลล์ที่ย้อมจะถูกสังเกตบนกล้องจุลทรรศน์แบบกลับหัว Nikon Eclipse Ti-E ภาพถูกถ่ายด้วยกล้อง CCD Hamamatsu ORCA-R2 ที่ทำความเย็นโดยใช้ซอฟต์แวร์ MetaMorph (Molecular Devices)
เวลาโพสต์ : 17 มิ.ย. 2567