การค้นพบ ลักษณะเฉพาะ และการปรับปรุงการทำงานของเออร์ซาโมโนเอไมด์ในฐานะสารยับยั้งการเจริญเติบโตของพืชชนิดใหม่ที่มีผลต่อไมโครทูบูลของพืช

ขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature.com เบราว์เซอร์ที่คุณใช้มีการรองรับ CSS ที่จำกัด เพื่อผลลัพธ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์เวอร์ชันใหม่กว่า (หรือปิดใช้งานโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) ในระหว่างนี้ เพื่อให้มั่นใจว่าการสนับสนุนจะดำเนินต่อไป เราจึงแสดงเว็บไซต์โดยไม่ใช้การออกแบบหรือ JavaScript
การค้นพบและการใช้ประโยชน์จากผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติสามารถช่วยพัฒนาคุณภาพชีวิตมนุษย์ได้ สารเคมียับยั้งการเจริญเติบโตของพืชถูกใช้อย่างแพร่หลายในฐานะสารกำจัดวัชพืชเพื่อควบคุมวัชพืช เนื่องจากความจำเป็นในการใช้สารกำจัดวัชพืชหลายประเภท จึงมีความจำเป็นที่จะต้องระบุสารประกอบที่มีกลไกการออกฤทธิ์ใหม่ๆ ในการศึกษานี้ เราได้ค้นพบสารประกอบ N-alkoxypyrrole ชนิดใหม่ คือ coumamonamide จาก Streptomyces werraensis MK493-CF1 และได้กำหนดกระบวนการสังเคราะห์ที่สมบูรณ์ จากการทดสอบฤทธิ์ทางชีวภาพ เราพบว่ากรด urs-monoamic เป็นสารตัวกลางสังเคราะห์ของ urs-monoamide และมีศักยภาพสารยับยั้งการเจริญเติบโตของพืชนอกจากนี้ เราได้พัฒนาอนุพันธ์ของกรดเออร์เบโนนิกหลายชนิด รวมถึงอนุพันธ์ของกรดเออร์เบนิลอกซี (UDA) ซึ่งมีฤทธิ์กำจัดวัชพืชสูงโดยไม่ส่งผลเสียต่อการเจริญเติบโตของเซลล์ HeLa นอกจากนี้ เรายังพบว่าอนุพันธ์ของกรดเออร์เบโนนิกสามารถรบกวนไมโครทูบูลของพืชได้ นอกจากนี้ KAND ยังส่งผลต่อเส้นใยแอคตินและกระตุ้นให้เซลล์ตาย ผลกระทบหลายแง่มุมเหล่านี้แตกต่างจากสารยับยั้งไมโครทูบูลที่เป็นที่รู้จัก และชี้ให้เห็นกลไกการออกฤทธิ์ใหม่ของกรดเออร์เบโนนิก ซึ่งเป็นข้อได้เปรียบสำคัญในการพัฒนาสารกำจัดวัชพืชชนิดใหม่
การค้นพบและการนำผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติที่มีประโยชน์และอนุพันธ์ไปใช้ในทางปฏิบัติ ถือเป็นหนทางหนึ่งในการพัฒนาคุณภาพชีวิตของมนุษย์ สารเมตาบอไลต์ทุติยภูมิที่ผลิตโดยจุลินทรีย์ พืช และแมลง นำไปสู่ความก้าวหน้าครั้งสำคัญทางการแพทย์และการเกษตร ยาปฏิชีวนะและยาต้านมะเร็งเม็ดเลือดขาวหลายชนิดได้รับการพัฒนาจากผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติ นอกจากนี้ ยังมียาต้านมะเร็งอีกหลายประเภทยาฆ่าแมลงสารฆ่าเชื้อราและสารกำจัดวัชพืชสกัดจากผลิตภัณฑ์ธรรมชาติเหล่านี้เพื่อใช้ในการเกษตร โดยเฉพาะอย่างยิ่ง สารกำจัดวัชพืชควบคุมวัชพืชเป็นเครื่องมือสำคัญในการเพิ่มผลผลิตพืชผลในการเกษตรสมัยใหม่ และสารประกอบหลายประเภทถูกนำมาใช้ในเชิงพาณิชย์แล้ว กระบวนการทางเซลล์หลายอย่างในพืช เช่น การสังเคราะห์แสง การเผาผลาญกรดอะมิโน การสังเคราะห์ผนังเซลล์ การควบคุมไมโทซิส การส่งสัญญาณฮอร์โมนพืช หรือการสังเคราะห์โปรตีน ถือเป็นเป้าหมายทั่วไปของสารกำจัดวัชพืช สารประกอบที่ยับยั้งการทำงานของไมโครทูบูลเป็นสารกำจัดวัชพืชประเภทหนึ่งที่มีผลต่อการเจริญเติบโตของพืชโดยส่งผลต่อการควบคุมไมโทซิส2
ไมโครทูบูลเป็นส่วนประกอบของไซโทสเกเลตันและพบมากในเซลล์ยูคาริโอต เฮเทอโรไดเมอร์ของทูบูลินประกอบด้วยอัลฟา-ทูบูลินและบีตา-ทูบูลิน ซึ่งก่อตัวเป็นโปรโตฟิลาเมนต์ไมโครทูบูลเชิงเส้น โดยมีโปรโตฟิลาเมนต์ 13 โปรโตฟิลาเมนต์ก่อตัวเป็นโครงสร้างทรงกระบอก ไมโครทูบูลมีบทบาทหลายอย่างในเซลล์พืช รวมถึงการกำหนดรูปร่างของเซลล์ การแบ่งเซลล์ และการลำเลียงภายในเซลล์3,4 เซลล์พืชมีไมโครทูบูลอยู่ใต้เยื่อหุ้มพลาสมาเฟสอินเตอร์เฟส และไมโครทูบูลคอร์ติคัลเหล่านี้เชื่อว่าควบคุมการจัดเรียงตัวของไมโครไฟบริลเซลลูโลสผ่านการควบคุมของคอมเพล็กซ์เซลลูโลสซินเทส4,5 ไมโครทูบูลคอร์ติคัลของเซลล์เยื่อบุผิวราก ซึ่งอยู่ในบริเวณที่ปลายรากยืดออกอย่างรวดเร็ว จะอยู่ด้านข้าง และไมโครไฟบริลเซลลูโลสจะตามหลังไมโครทูบูลเหล่านี้และจำกัดทิศทางการขยายตัวของเซลล์ จึงส่งเสริมการยืดตัวของเซลล์แบบแอนไอโซทรอปิก ดังนั้น การทำงานของไมโครทูบูลจึงสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับสัณฐานวิทยาของพืช การแทนที่กรดอะมิโนในยีนที่เข้ารหัสทูบูลินทำให้เกิดการเบี่ยงเบนของไมโครทูบูลในคอร์เทกซ์และการเจริญเติบโตด้านซ้ายหรือด้านขวาใน Arabidopsis 6,7 เช่นเดียวกัน การกลายพันธุ์ในโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไมโครทูบูลซึ่งควบคุมพลวัตของไมโครทูบูลก็อาจนำไปสู่การเจริญเติบโตของรากที่ผิดเพี้ยนได้เช่นกัน8,9,10,11,12,13 นอกจากนี้ การบำบัดด้วยสารกำจัดวัชพืชที่รบกวนการทำงานของไมโครทูบูล เช่น ไดโซไพราไมด์ หรือที่รู้จักกันในชื่อเพรทิลาคลอร์ ก็ทำให้เกิดการเจริญเติบโตของรากเอียงด้านซ้ายเช่นกัน14 ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่าการควบคุมการทำงานของไมโครทูบูลอย่างแม่นยำมีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการกำหนดทิศทางการเจริญเติบโตของพืช
มีการค้นพบสารยับยั้งไมโครทูบูลหลายประเภท และยาเหล่านี้มีส่วนสำคัญอย่างยิ่งต่อการวิจัยโครงร่างเซลล์ รวมถึงด้านการเกษตรและการแพทย์2 โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ออไรซาลิน สารประกอบไดไนโตรอะนิลีน ไดโซไพราไมด์ สารประกอบที่เกี่ยวข้องกับเบนซาไมด์ และสารประกอบแอนะล็อกของสารเหล่านี้ สามารถยับยั้งการทำงานของไมโครทูบูลและยับยั้งการเจริญเติบโตของพืชได้ ดังนั้นจึงมีการใช้กันอย่างแพร่หลายในฐานะสารกำจัดวัชพืช อย่างไรก็ตาม เนื่องจากไมโครทูบูลเป็นองค์ประกอบสำคัญของเซลล์พืชและเซลล์สัตว์ สารยับยั้งไมโครทูบูลส่วนใหญ่จึงเป็นพิษต่อเซลล์ทั้งสองชนิด ดังนั้น แม้ว่าจะได้รับการยอมรับว่ามีประโยชน์ในฐานะสารกำจัดวัชพืช แต่ก็มีสารต้านไมโครทูบูลจำนวนจำกัดที่ถูกนำมาใช้ในทางปฏิบัติ
สเตรปโตไมซีสเป็นสกุลหนึ่งในวงศ์ Streptomyces ซึ่งประกอบด้วยแบคทีเรียแอโรบิก แบคทีเรียแกรมบวก และแบคทีเรียเส้นใย และเป็นที่รู้จักอย่างกว้างขวางในด้านความสามารถในการผลิตสารเมตาบอไลต์ทุติยภูมิที่หลากหลาย ดังนั้นจึงถือเป็นหนึ่งในแหล่งที่สำคัญที่สุดของผลิตภัณฑ์ธรรมชาติที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพใหม่ ในการศึกษานี้ เราค้นพบสารประกอบใหม่ที่เรียกว่าคูมาโมนาไมด์ ซึ่งแยกได้จาก Streptomyces werraensis MK493-CF1 และ S. werraensis ISP 5486 โดยใช้การวิเคราะห์สเปกตรัมและการวิเคราะห์สเปกตรัมเต็มรูปแบบ โครงสร้างของคูมาโมนาไมด์ถูกระบุลักษณะและระบุโครงสร้าง N-alkoxypyrrole ที่เป็นเอกลักษณ์ การสังเคราะห์ พบว่ากรดเออร์โมโนนิก ซึ่งเป็นสารตัวกลางสังเคราะห์ของเออร์โมโนอะไมด์และอนุพันธ์ สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตและการงอกของพืชต้นแบบยอดนิยม Arabidopsis thaliana ได้ ในการศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างและฤทธิ์ เราพบว่าสารประกอบ C9 ที่ดัดแปลงเป็นกรดเออร์โซนิก เรียกว่า อนุพันธ์โนนิลออกซีของกรดเออร์โซนิก (KAND) ช่วยเพิ่มฤทธิ์ยับยั้งการเจริญเติบโตและการงอกอย่างมีนัยสำคัญ ที่น่าสังเกตคือ สารยับยั้งการเจริญเติบโตของพืชที่เพิ่งค้นพบนี้ยังส่งผลต่อการเจริญเติบโตของยาสูบและลิเวอร์เวิร์ต และไม่เป็นพิษต่อแบคทีเรียหรือเซลล์ HeLa ยิ่งไปกว่านั้น อนุพันธ์ของกรดเออร์โมโทนิกบางชนิดยังทำให้เกิดลักษณะทางฟีโนไทป์ของรากที่ผิดเพี้ยน ซึ่งหมายความว่าอนุพันธ์เหล่านี้มีผลต่อไมโครทูบูลทั้งทางตรงและทางอ้อม สอดคล้องกับแนวคิดนี้ การสังเกตไมโครทูบูลที่ติดฉลากด้วยอิมมูโนฮิสโตเคมีหรือโปรตีนเรืองแสงของเราบ่งชี้ว่าการรักษาด้วย KAND จะทำให้ไมโครทูบูลสลายตัว นอกจากนี้ การรักษาด้วยอนุพันธ์ของกรดคูมาโมโทนิกยังทำลายไมโครฟิลาเมนต์แอคติน ดังนั้นเราจึงค้นพบสารยับยั้งการเจริญเติบโตของพืชชนิดใหม่ที่มีกลไกการออกฤทธิ์เฉพาะตัว คือการทำลายโครงร่างเซลล์
สายพันธุ์ MK493-CF1 แยกได้จากดินในเขตชินางาวะ โตเกียว สายพันธุ์ MK493-CF1 สร้างเส้นใยสโตรมัลที่มีกิ่งก้านสาขาดี ลำดับเบสบางส่วนของยีน 16S ribosomal RNA (1422 bp) ได้รับการพิจารณา สายพันธุ์นี้มีความคล้ายคลึงกับ S. werraensis มาก (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: สายพันธุ์ทั่วไป, 99.93%) จากผลการทดลองนี้ พบว่าสายพันธุ์นี้มีความสัมพันธ์ใกล้ชิดกับสายพันธุ์ต้นแบบของ S. werraensis ดังนั้นเราจึงตั้งชื่อสายพันธุ์นี้ไว้ชั่วคราวว่า S. werraensis MK493-CF1 S. werraensis ISP 5486T ยังผลิตสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพชนิดเดียวกันนี้ด้วย เนื่องจากมีการวิจัยเบื้องต้นเกี่ยวกับการสกัดผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติจากจุลินทรีย์ชนิดนี้น้อยมาก จึงได้มีการวิจัยทางเคมีเพิ่มเติม หลังจากเพาะเลี้ยง S. werraensis MK493-CF1 บนอาหารข้าวบาร์เลย์โดยการหมักแบบของแข็งที่อุณหภูมิ 30°C เป็นเวลา 14 วัน สกัดอาหารด้วยเอทานอล 50% เก็บตัวอย่าง 60 มล. อบแห้งเพื่อให้ได้สารสกัดหยาบ 59.5 มก. สารสกัดหยาบถูกนำไปวิเคราะห์ด้วยเทคนิค reverse phase HPLC เพื่อให้ได้ N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, ชื่อ coumamonamide, 36.0 มก.) ปริมาณรวมของ 1 คิดเป็นประมาณ 60% ของสารสกัดหยาบ ดังนั้นเราจึงตัดสินใจศึกษาคุณสมบัติของ kumamotoamide 1 โดยละเอียด
คูมาโมนาไมด์ 1 เป็นผงอสัณฐานสีขาว และการวิเคราะห์มวลสารความละเอียดสูง (HRESIMS) ยืนยัน C6H8N2O2 (รูปที่ 1) เศษไพร์โรลที่ถูกแทนที่ด้วย C2 ของสารประกอบนี้มีลักษณะเฉพาะคือ δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH ในสเปกตรัม 1H NMR: 4.5 Hz, H-5) และ δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) และสเปกตรัม 13C NMR แสดงให้เห็นว่ามีอะตอมคาร์บอน sp2 สี่อะตอม การมีหมู่อะไมด์ที่ตำแหน่ง C2 ประเมินโดยการหาความสัมพันธ์ของ HMBC จากโปรตอน C-3 กับคาร์บอนิลของอะไมด์ที่ δC 161.1 นอกจากนี้ จุดสูงสุดของ NMR 1H และ 13C ที่ δH 4.10 (3H, S) และ δC 68.3 บ่งชี้ว่ามีหมู่ N-เมทอกซีอยู่ในโมเลกุล แม้ว่าตำแหน่งที่ถูกต้องของหมู่เมทอกซียังไม่สามารถระบุได้โดยใช้การวิเคราะห์สเปกโทรสโกปี เช่น สเปกโทรสโกปีแบบ Enhanced Difference และ Nuclear Overhauser (NOEDF) แต่ N-เมทอกซี-1H-ไพร์โรล-2-คาร์บอกซาไมด์ก็กลายเป็นสารประกอบตัวแรกที่ได้รับการพิจารณา
เพื่อหาโครงสร้างที่ถูกต้องของ 1 จึงทำการสังเคราะห์ทั้งหมด (รูปที่ 2a) การบำบัด 2-aminopyridine 2 ที่มีจำหน่ายในท้องตลาดด้วย m-CPBA ส่งผลให้ได้ N-oxide 3 ที่สอดคล้องกันในเชิงปริมาณ หลังจาก 2-aminoazidation ของ 2 แล้ว ปฏิกิริยาไซโคลคอนเดนเซชันที่อธิบายโดย Abramovich ได้ถูกดำเนินการในเบนซินที่อุณหภูมิ 90°C เพื่อให้ได้ 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 ที่ต้องการในหน่วยกรัม ความเร็ว 60% (สองขั้นตอน) 15,16 จากนั้นเมทิลเลชันและไฮโดรไลซิสของ 4 จะให้ 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylic acid (เรียกว่า “cumotonic acid”, 6) ซึ่งให้ผลผลิตที่ดี (70%, สองขั้นตอน) สุดท้าย การทำให้เป็นอะมิเดชันผ่านกรดคลอไรด์ตัวกลาง 6 โดยใช้แอมโมเนียในน้ำทำให้ได้ Kumamoto amide 1 ที่ให้ผลผลิต 98% ข้อมูลสเปกตรัมทั้งหมดของ 1 ที่สังเคราะห์นั้นคล้ายคลึงกับ 1 ที่แยกออกมา ดังนั้นจึงสามารถกำหนดโครงสร้างของ 1 ได้
การสังเคราะห์และวิเคราะห์ฤทธิ์ทางชีวภาพของเออร์เบนาไมด์และกรดเออร์เบนิกโดยทั่วไป (ก) การสังเคราะห์ทั้งหมดของคูมาโมโตะเอไมด์ (ข) ต้นกล้าพันธุ์ป่า Arabidopsis Columbia (Col) อายุเจ็ดวัน เพาะเลี้ยงบนแผ่น Murashige และ Skoog (MS) ที่มีคูมาโมนาไมด์ 6 หรือคูมาโมนาไมด์ 1 ตามความเข้มข้นที่ระบุ แถบมาตราส่วน = 1 ซม.
ขั้นแรก เราได้ประเมินฤทธิ์ทางชีวภาพของเออร์เบนาไมด์และสารตั้งต้นของเออร์เบนาไมด์สำหรับความสามารถในการควบคุมการเจริญเติบโตของพืช เราได้เติมเออร์สโมนาไมด์ 1 หรือกรดเออร์สโมนิก 6 ความเข้มข้นต่างๆ ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ MS agar และเพาะเลี้ยงต้นกล้า Arabidopsis thaliana บนอาหารเลี้ยงเชื้อนี้ ผลการทดสอบแสดงให้เห็นว่าความเข้มข้นสูง (500 ไมโครโมลาร์) ของ 6 ยับยั้งการเจริญเติบโตของราก (รูปที่ 2b) ขั้นต่อไป เราได้ผลิตอนุพันธ์ต่างๆ โดยการแทนที่ตำแหน่ง N1 ของ 6 และทำการศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างกับฤทธิ์ของอนุพันธ์เหล่านั้น (กระบวนการสังเคราะห์อะนาล็อกอธิบายไว้ในข้อมูลสนับสนุน (SI)) ต้นกล้า Arabidopsis ถูกปลูกบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีอนุพันธ์ของกรดเออร์สโมนิก 50 ไมโครโมลาร์ และวัดความยาวราก ดังที่แสดงในภาพ ดังแสดงในรูปที่ 3a, b และ S1 กรดคูมาโมมีสายโซ่อัลคอกซีเชิงเส้น (9, 10, 11, 12 และ 13) หรือสายโซ่อัลคอกซีขนาดใหญ่ (15, 16 และ 17) ที่ตำแหน่ง N1 ที่มีความยาวต่างกัน อนุพันธ์เหล่านี้แสดงฤทธิ์ยับยั้งการเจริญเติบโตของรากอย่างมีนัยสำคัญ นอกจากนี้ เราพบว่าการใช้ 10, 11 หรือ 17 ความเข้มข้น 200 ไมโครโมลาร์ ยับยั้งการงอก (รูปที่ 3c และ S2)
การศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างและฤทธิ์ของสารอะไมด์คุมาโมโตะและสารประกอบที่เกี่ยวข้อง (ก) โครงสร้างและรูปแบบการสังเคราะห์สารอะนาล็อก (ข) การหาปริมาณความยาวรากของต้นกล้าอายุ 7 วันที่ปลูกบนอาหาร MS ที่มีหรือไม่มีอนุพันธ์คูมาโมนาไมด์ความเข้มข้น 50 ไมโครโมลาร์ เครื่องหมายดอกจันแสดงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญกับการทดลองหลอก (t test, p)< 0.05). n>18. ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน nt หมายถึง “ไม่ได้ทดสอบ” เนื่องจากเมล็ดมากกว่า 50% ไม่งอก (c) การหาปริมาณอัตราการงอกของเมล็ดที่ผ่านการบำบัดแล้ว บ่มเพาะเป็นเวลา 7 วันในอาหารเลี้ยงเชื้อ MS ที่มีหรือไม่มีคูมาโมนาไมด์ความเข้มข้น 200 ไมโครโมลาร์และสารประกอบที่เกี่ยวข้อง เครื่องหมายดอกจันแสดงถึงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญกับการทดลองหลอก (การทดสอบไคสแควร์) n=96
ที่น่าสนใจคือ การเพิ่มโซ่ข้างของอัลคิลที่ยาวกว่า C9 ทำให้กิจกรรมการยับยั้งลดลง ซึ่งชี้ให้เห็นว่าสารประกอบที่เกี่ยวข้องกับกรดคุมาโมโตอิกจำเป็นต้องมีโซ่ข้างที่มีขนาดหนึ่งเพื่อแสดงกิจกรรมทางชีวภาพ
เนื่องจากการวิเคราะห์ความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างและฤทธิ์พบว่า C9 ถูกดัดแปลงเป็นกรดเออร์โซนิก และอนุพันธ์โนนิลออกซีของกรดเออร์โซนิก (ต่อไปนี้จะเรียกว่า KAND 11) เป็นสารยับยั้งการเจริญเติบโตของพืชที่มีประสิทธิภาพสูงสุด เราจึงได้ศึกษาลักษณะของ KAND 11 อย่างละเอียดมากขึ้น การบำบัด Arabidopsis ด้วย KAND 11 ความเข้มข้น 50 ไมโครโมลาร์ สามารถป้องกันการงอกได้เกือบสมบูรณ์ ในขณะที่ KAND 11 ความเข้มข้นต่ำกว่า (40, 30, 20 หรือ 10 ไมโครโมลาร์) สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของรากได้ในลักษณะที่ขึ้นกับปริมาณยา (รูปที่ 4a, b) เพื่อทดสอบว่า KAND 11 มีผลต่อความมีชีวิตของรากเจริญหรือไม่ เราจึงตรวจสอบรากเจริญที่ย้อมด้วยโพรพิเดียมไอโอไดด์ (PI) และวัดขนาดพื้นที่ของรากเจริญ ขนาดของเนื้อเยื่อเจริญของต้นกล้าที่ปลูกในอาหารที่มี KAND-11 ความเข้มข้น 25 ไมโครโมลาร์ มีขนาด 151.1 ± 32.5 ไมโครเมตร ในขณะที่ขนาดของเนื้อเยื่อเจริญของต้นกล้าที่ปลูกในอาหารควบคุมที่มี DMSO มีขนาด 264.7 ± 30.8 ไมโครเมตร (รูปที่ 4c, d) ซึ่งบ่งชี้ว่า KAND-11 ช่วยฟื้นฟูกิจกรรมของเซลล์ การแพร่กระจายของเนื้อเยื่อเจริญราก สอดคล้องกับผลการทดลองนี้ การรักษาด้วย KAND 11 ช่วยลดปริมาณสัญญาณ CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS ซึ่งเป็นตัวบ่งชี้การแบ่งเซลล์ในเนื้อเยื่อเจริญราก (รูปที่ 4e) 17 ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า KAND 11 ยับยั้งการเจริญเติบโตของรากโดยลดกิจกรรมการแบ่งเซลล์
การวิเคราะห์ฤทธิ์ยับยั้งการเจริญเติบโตของอนุพันธ์ของกรดเออร์เบโนนิก (อนุพันธ์ของกรดเออร์เบนิลอกซี) (ก) ต้นกล้าพันธุ์ Col ชนิดป่าอายุ 7 วัน ปลูกบนจาน MS ที่มีความเข้มข้นของ KAND 11 ตามที่ระบุไว้ มาตราส่วน = 1 ซม. (ข) การวัดความยาวราก ตัวอักษรแสดงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (การทดสอบ Tukey HSD, หน้า< 0.05). n>16. ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (c) กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลของราก Col ชนิดป่าที่ย้อมด้วยโพรพิดิอัมไอโอไดด์ที่ปลูกบนแผ่น MS ที่มีหรือไม่มี 25 ไมโครโมลาร์ KAND 11 วงเล็บสีขาวแสดงเนื้อเยื่อเจริญของราก มาตราส่วน = 100 ไมโครเมตร (d) การหาปริมาณขนาดของเนื้อเยื่อเจริญของราก (n = 10 ถึง 11) ความแตกต่างทางสถิติถูกกำหนดโดยใช้การทดสอบ t (p< 0.05) แถบแสดงขนาดเฉลี่ยของยอดเจริญ (e) กล้องจุลทรรศน์ความคมชัดแบบ Differential Interference Contrast (DIC) ของยอดเจริญรากที่มีโครงสร้าง CDKB2; 1pro: CDKB2; ย้อม 1-GUS และย้อมบนต้นกล้าอายุ 5 วันที่ปลูกบนแผ่น MS ที่มีหรือไม่มีวิธีทดสอบ KAND 25 µM
ความเป็นพิษต่อพืชของ KAND 11 ได้รับการทดสอบเพิ่มเติมโดยใช้พืชใบเลี้ยงคู่อีกชนิดหนึ่งคือยาสูบ (Nicotiana tabacum) และลิเวอร์เวิร์ต (Marchantia polymorpha) ซึ่งเป็นพืชต้นแบบที่สำคัญ เช่นเดียวกับในกรณีของ Arabidopsis ต้นกล้ายาสูบ SR-1 ที่ปลูกในอาหารที่มี KAND 11 ความเข้มข้น 25 ไมโครโมลาร์ มีรากที่สั้นกว่า (รูปที่ 5a) นอกจากนี้ เมล็ด 40 เมล็ดจาก 48 เมล็ดงอกบนจานเพาะที่มี KAND 11 ความเข้มข้น 200 ไมโครโมลาร์ ในขณะที่เมล็ดทั้ง 48 เมล็ดงอกบนอาหารเพาะแบบจำลอง ซึ่งบ่งชี้ว่าความเข้มข้นของ KAND ที่สูงขึ้นมีนัยสำคัญ (p)< 0.05; การทดสอบไคสแควร์) ยับยั้งการงอกของยาสูบ (รูปที่ 5b) นอกจากนี้ ความเข้มข้นของ KAND 11 ที่ยับยั้งการเจริญเติบโตของแบคทีเรียในลิเวอร์เวิร์ตยังใกล้เคียงกับความเข้มข้นที่มีประสิทธิภาพใน Arabidopsis (รูปที่ 5c) ผลการทดลองเหล่านี้บ่งชี้ว่า KAND 11 สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของพืชได้หลากหลายชนิด จากนั้นเราจึงศึกษาความเป็นพิษต่อเซลล์ที่อาจเกิดขึ้นของสารประกอบที่เกี่ยวข้องกับโมโนเอไมด์ของหมีในสิ่งมีชีวิตอื่นๆ ได้แก่ เซลล์ HeLa ของมนุษย์ และ Escherichia coli สายพันธุ์ DH5α ซึ่งเป็นตัวแทนของเซลล์สัตว์และเซลล์แบคทีเรียระดับสูงตามลำดับ จากการทดสอบการเพิ่มจำนวนเซลล์หลายครั้ง เราพบว่า coumamonamide 1, coumamonamidic acid 6 และ KAND 11 ไม่มีผลต่อการเจริญเติบโตของเซลล์ HeLa หรือ E. coli ที่ความเข้มข้น 100 ไมโครโมลาร์ (รูปที่ 5d, e)
การยับยั้งการเจริญเติบโตของ KAND 11 ในสิ่งมีชีวิตที่ไม่ใช่ Arabidopsis (ก) ต้นกล้ายาสูบ SR-1 ชนิดป่าอายุสองสัปดาห์ปลูกบนจาน MS ที่วางในแนวตั้งซึ่งมี KAND 11 ความเข้มข้น 25 ไมโครโมลาร์ (ข) ต้นกล้ายาสูบ SR-1 ชนิดป่าอายุสองสัปดาห์ปลูกบนจาน MS ที่วางในแนวนอนซึ่งมี KAND 11 ความเข้มข้น 200 ไมโครโมลาร์ (ค) หน่อลิเวอร์เวิร์ต Tak-1 ชนิดป่าอายุสองสัปดาห์ปลูกบนจาน Gamborg B5 ที่มีความเข้มข้นของ KAND 11 ตามที่ระบุไว้ ลูกศรสีแดงแสดงสปอร์ที่หยุดการเจริญเติบโตภายในระยะฟักตัวสองสัปดาห์ (ง) การทดสอบการเพิ่มจำนวนเซลล์ของเซลล์ HeLa จำนวนเซลล์ที่มีชีวิตถูกวัดในช่วงเวลาที่กำหนดโดยใช้ชุดนับเซลล์หมายเลข 8 (Dojindo) เซลล์ HeLa ได้รับแอคติโนไมซิน ดี (Act D) ความเข้มข้น 5 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร เป็นตัวควบคุม ซึ่งยับยั้งการถอดรหัสของ RNA polymerase และทำให้เกิดการตายของเซลล์ การวิเคราะห์ดำเนินการซ้ำสามครั้ง (e) การทดสอบการเพิ่มจำนวนเซลล์ของเชื้ออี. โคไล การวิเคราะห์การเจริญเติบโตของเชื้ออี. โคไลโดยการวัดค่า OD600 เซลล์ได้รับแอมพิซิลลิน (Amp) ความเข้มข้น 50 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร เพื่อเป็นตัวควบคุม ซึ่งยับยั้งการสังเคราะห์ผนังเซลล์ของแบคทีเรีย การวิเคราะห์ดำเนินการซ้ำสามครั้ง
เพื่อถอดรหัสกลไกการออกฤทธิ์ของความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เกิดจากสารประกอบที่เกี่ยวข้องกับยูราไมด์ เราได้วิเคราะห์อนุพันธ์ของกรดเออร์เบนิกที่มีฤทธิ์ยับยั้งปานกลางอีกครั้ง ดังที่แสดงในภาพ ดังแสดงในรูปที่ 2b, 6a ต้นกล้าที่ปลูกบนจานวุ้นที่มีกรดเออร์โมโทนิก 6 ความเข้มข้นสูง (200 ไมโครโมลาร์) จะให้รากที่สั้นกว่าและโค้งไปทางซ้าย (θ = – 23.7 ± 6.1) ในขณะที่ต้นกล้าที่ปลูกบนอาหารควบคุม ต้นกล้าจะมีรากที่เกือบตรง (θ = – 3.8 ± 7.1) การเจริญเติบโตแบบเฉียงลักษณะนี้ทราบกันว่าเป็นผลมาจากความผิดปกติของไมโครทูบูลในเปลือกสมอง14,18 สอดคล้องกับผลการวิจัยนี้ ยาไดโซไพราไมด์และออไรซาลินซึ่งเป็นยาที่ทำให้ไมโครทูบูลไม่เสถียร ทำให้เกิดการเอียงของรากในลักษณะเดียวกันภายใต้สภาวะการเจริญเติบโตของเรา (รูปที่ 2b, 6a) ในเวลาเดียวกัน เราได้ทดสอบอนุพันธ์ของกรดเออร์โมโทนิกและคัดเลือกสารหลายชนิดที่ความเข้มข้นที่กำหนดสามารถกระตุ้นการเจริญเติบโตของรากแบบเอียงได้ สารประกอบ 8, 9 และ 15 เปลี่ยนทิศทางการเจริญเติบโตของรากที่ความเข้มข้น 75 ไมโครโมลาร์, 50 ไมโครโมลาร์ และ 40 ไมโครโมลาร์ ตามลำดับ ซึ่งบ่งชี้ว่าสารประกอบเหล่านี้สามารถทำให้ไมโครทูบูลไม่เสถียรได้อย่างมีประสิทธิภาพ (รูปที่ 2b, 6a) นอกจากนี้ เรายังทดสอบอนุพันธ์ของกรดเออร์โซลิกที่มีฤทธิ์แรงที่สุด คือ KAND 11 ที่ความเข้มข้นต่ำกว่า (15 ไมโครโมลาร์) และพบว่าการใช้ KAND 11 ยับยั้งการเจริญเติบโตของรากและทิศทางการเจริญเติบโตของรากไม่สม่ำเสมอ แม้ว่ามีแนวโน้มเอียงไปทางซ้ายก็ตาม (รูปที่ C3) เนื่องจากยาที่ออกฤทธิ์ยับยั้งไมโครทูบูลในความเข้มข้นที่สูงขึ้นบางครั้งอาจยับยั้งการเจริญเติบโตของพืชมากกว่าทำให้รากเอียง เราจึงประเมินความเป็นไปได้ในภายหลังว่า KAND 11 มีผลต่อไมโครทูบูลโดยการสังเกตไมโครทูบูลในคอร์เทกซ์เซลล์เยื่อบุผิวราก อิมมูโนฮิสโตเคมีโดยใช้แอนติบอดีต่อเบต้าทูบูลินในเซลล์ผิวหนังชั้นนอกของรากต้นกล้าที่ได้รับ KAND 11 ความเข้มข้น 25 ไมโครโมลาร์ พบว่าไมโครทูบูลในเปลือกเซลล์เกือบทั้งหมดหายไปในเซลล์ผิวหนังชั้นนอกบริเวณอีลองเกชัน (รูปที่ 6b) ผลการศึกษานี้บ่งชี้ว่ากรดคุมะโมโทนิกและอนุพันธ์ของกรดคุมะโมโทนิกออกฤทธิ์โดยตรงหรือโดยอ้อมต่อไมโครทูบูลเพื่อทำลายไมโครทูบูล และสารประกอบเหล่านี้เป็นสารยับยั้งไมโครทูบูลชนิดใหม่
กรดเออร์โซนิกและอนุพันธ์ของกรดนี้ทำให้ไมโครทูบูลในคอร์เทกซ์เปลี่ยนแปลงไปใน Arabidopsis thaliana (ก) มุมเอียงของรากที่วัดเมื่อมีอนุพันธ์ของกรดเออร์โมโทนิกหลายชนิดที่ความเข้มข้นที่ระบุ นอกจากนี้ยังได้วิเคราะห์ผลของสารประกอบสองชนิดที่ทราบกันว่าสามารถยับยั้งไมโครทูบูลได้ ได้แก่ ไดโซไพราไมด์และออไรซาลิน ภาพแทรกแสดงมาตรฐานที่ใช้วัดมุมการเจริญเติบโตของราก เครื่องหมายดอกจันบ่งชี้ความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญกับการรักษาแบบหลอก (t test, p)< 0.05). n>19. มาตราส่วน = 1 ซม. (b) ไมโครทูบูลคอร์ติคัลในเซลล์ผิวหนังชั้นนอกในบริเวณอีลองเกชัน ไมโครทูบูลในราก Arabidopsis Col ชนิดป่าที่ปลูกบนแผ่น MS ที่มีหรือไม่มี KAND 11 ความเข้มข้น 25 ไมโครโมลาร์ ถูกมองเห็นโดยการย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมีโดยใช้แอนติบอดีปฐมภูมิ β-ทูบูลิน และแอนติบอดีทุติยภูมิที่คอนจูเกตกับ Alexa Fluor มาตราส่วน = 10 ไมโครเมตร (c) โครงสร้างไมโทซิสของไมโครทูบูลในเนื้อเยื่อเจริญราก ไมโครทูบูลถูกมองเห็นโดยการย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมี โครงสร้างไมโทซิส รวมถึงโซนโปรเฟส สปินเดิล และแฟรกโมพลาสต์ ถูกนับจากภาพคอนโฟคัล ลูกศรแสดงโครงสร้างไมโครทูบูลไมโทซิส เครื่องหมายดอกจันแสดงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญกับการรักษาหลอก (t test, p)< 0.05). n>9. มาตราส่วน = 50 µm
แม้ว่า Ursa จะมีความสามารถในการขัดขวางการทำงานของไมโครทูบูล แต่กลไกการออกฤทธิ์คาดว่าจะแตกต่างจากสารดีพอลิเมอร์ไรเซชันของไมโครทูบูลทั่วไป ตัวอย่างเช่น สารดีพอลิเมอร์ไรเซชันของไมโครทูบูลที่มีความเข้มข้นสูงกว่า เช่น ไดโซไพราไมด์และออริซาลิน จะกระตุ้นให้เซลล์ผิวหนังขยายตัวแบบแอนไอโซทรอปิก ในขณะที่ KAND 11 ไม่เป็นเช่นนั้น นอกจากนี้ การใช้ KAND 11 ร่วมกับไดโซไพราไมด์ยังทำให้เกิดการตอบสนองการเจริญเติบโตของรากที่เกิดจากไดโซไพราไมด์และการยับยั้งการเจริญเติบโตที่เกิดจาก KAND 11 (รูปที่ S4) นอกจากนี้ เรายังวิเคราะห์การตอบสนองของสารกลายพันธุ์ไดโซไพราไมด์ 1-1 (phs1-1) ที่ไวต่อ KAND 11 พบว่า phs1-1 มีการกลายพันธุ์แบบทูบูลินไคเนสที่ไม่ใช่แบบปกติ และรากจะสั้นลงเมื่อได้รับไดโซไพราไมด์9,20 ต้นกล้ากลายพันธุ์ phs1-1 ที่ปลูกบนอาหารวุ้นที่มี KAND 11 มีรากสั้นกว่าคล้ายกับต้นกล้าที่ปลูกบนไดโซพีระมิด (รูปที่ S5)
นอกจากนี้ เรายังสังเกตเห็นโครงสร้างไมโครทูบูลไมโทซิส เช่น โซนโปรเฟส สปินเดิล และแฟรกโมพลาสต์ ในเนื้อเยื่อเจริญรากของต้นกล้าที่ได้รับการรักษาด้วย KAND 11 สอดคล้องกับการสังเกต CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS พบว่าจำนวนไมโครทูบูลไมโทซิสลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 6c)
เพื่อศึกษาความเป็นพิษของ KAND 11 ที่ระดับความละเอียดระดับเซลล์ย่อย เราจึงได้ทดลองกับเซลล์แขวนลอย BY-2 ของยาสูบด้วย KAND 11 และสังเกตการตอบสนองของเซลล์เหล่านั้น ขั้นแรก เราได้เติม KAND 11 ลงในเซลล์ BY-2 ที่มีการแสดงออกของ TagRFP-TUA6 ซึ่งติดฉลากไมโครทูบูลด้วยสารเรืองแสง เพื่อประเมินผลของ KAND 11 ต่อไมโครทูบูลในคอร์เทกซ์ ความหนาแน่นของไมโครทูบูลในคอร์เทกซ์ถูกประเมินโดยใช้การวิเคราะห์ภาพ ซึ่งหาปริมาณเปอร์เซ็นต์ของพิกเซลโครงร่างเซลล์ในบรรดาพิกเซลไซโทพลาสซึม ผลการทดสอบแสดงให้เห็นว่าหลังจากการทดลองกับ KAND 11 ที่ความเข้มข้น 50 ไมโครโมลาร์ หรือ 100 ไมโครโมลาร์ เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ความหนาแน่นลดลงอย่างมีนัยสำคัญเหลือ 0.94 ± 0.74% หรือ 0.23 ± 0.28% ตามลำดับ ในขณะที่ความหนาแน่นของเซลล์ที่ได้รับการรักษาด้วย DMSO มีค่าเท่ากับ 1.61 ± 0.34% (รูปที่ 7a) ผลลัพธ์เหล่านี้สอดคล้องกับการสังเกตใน Arabidopsis ที่ว่าการรักษาด้วย KAND 11 ทำให้เกิดการดีพอลิเมอไรเซชันของไมโครทูบูลในคอร์เทกซ์ (รูปที่ 6b) นอกจากนี้ เรายังตรวจสอบสาย BY-2 ที่มีเส้นใยแอคตินที่ติดฉลาก GFP-ABD หลังจากการรักษาด้วย KAND 11 ในความเข้มข้นเดียวกัน และพบว่าการรักษาด้วย KAND 11 ทำลายเส้นใยแอคติน การรักษาด้วย KAND 11 ความเข้มข้น 50 ไมโครโมลาร์ หรือ 100 ไมโครโมลาร์ เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ลดความหนาแน่นของเส้นใยแอคตินลงอย่างมีนัยสำคัญเหลือ 1.20 ± 0.62% หรือ 0.61 ± 0.26% ตามลำดับ ในขณะที่ความหนาแน่นในเซลล์ที่ได้รับการรักษาด้วย DMSO อยู่ที่ 1.69 ± 0.51% (รูปที่ 2) (7b) ผลลัพธ์เหล่านี้ตรงกันข้ามกับผลของโพรพิซาไมด์ ซึ่งไม่มีผลต่อเส้นใยแอคติน และลาทรันคูลิน บี ซึ่งเป็นสารดีพอลิเมอไรเซอร์แอคตินที่ไม่มีผลต่อไมโครทูบูล (SI รูปที่ S6) นอกจากนี้ การรักษาด้วย coumamonamide 1, coumamonamide acid 6 หรือ KAND 11 ไม่มีผลต่อไมโครทูบูลในเซลล์ HeLa (SI รูปที่ S7) ดังนั้น เชื่อว่ากลไกการออกฤทธิ์ของ KAND 11 แตกต่างจากกลไกการออกฤทธิ์ของสารก่อการรบกวนโครงร่างเซลล์ที่ทราบกันดีอยู่แล้ว นอกจากนี้ การสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์ของเซลล์ BY-2 ที่ได้รับการรักษาด้วย KAND 11 เผยให้เห็นจุดเริ่มต้นของการตายของเซลล์ระหว่างการรักษาด้วย KAND 11 และแสดงให้เห็นว่าสัดส่วนของเซลล์ที่ตายแล้วที่ย้อมด้วยสี Evans blue ไม่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังจากการรักษาด้วย KAND 11 เป็นเวลา 30 นาที ในขณะที่หลังจากการรักษาด้วย KAND 50 μM หรือ 100 μM เป็นเวลา 90 นาที จำนวนเซลล์ที่ตายแล้วเพิ่มขึ้นเป็น 43.7% หรือ 80.1% ตามลำดับ (รูปที่ 7c) เมื่อพิจารณาโดยรวมแล้ว ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่า KAND 11 ซึ่งเป็นอนุพันธ์ของกรดเออร์โซลิกชนิดใหม่นี้เป็นสารยับยั้งโครงร่างเซลล์ที่จำเพาะต่อพืช ซึ่งมีกลไกการออกฤทธิ์ที่ยังไม่เป็นที่ทราบมาก่อน
KAND มีผลต่อไมโครทูบูลในคอร์เทกซ์ เส้นใยแอคติน และความมีชีวิตของเซลล์ BY-2 จากยาสูบ (ก) การมองเห็นไมโครทูบูลในคอร์เทกซ์ในเซลล์ BY-2 เมื่อมี TagRFP-TUA6 เซลล์ BY-2 ที่ได้รับการรักษาด้วย KAND 11 (50 ไมโครโมลาร์ หรือ 100 ไมโครโมลาร์) หรือ DMSO ได้รับการตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคัล ความหนาแน่นของไมโครทูบูลในคอร์เทกซ์คำนวณจากภาพไมโครกราฟของเซลล์อิสระ 25 เซลล์ ตัวอักษรแสดงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (การทดสอบ Tukey HSD, หน้า< 0.05) แถบมาตราส่วน = 10 µm (b) เส้นใยแอคตินในคอร์เทกซ์เซลล์ BY-2 ที่มองเห็นโดยมี GFP-ABD2 เซลล์ BY-2 ที่ได้รับการรักษาด้วย KAND 11 (50 µM หรือ 100 µM) หรือ DMSO ได้รับการตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล ความหนาแน่นของเส้นใยแอคตินในคอร์เทกซ์คำนวณจากภาพไมโครกราฟของเซลล์อิสระ 25 เซลล์ ตัวอักษรแสดงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (การทดสอบ Tukey HSD, หน้า< 0.05) มาตราส่วน = 10 µm (c) การสังเกตเซลล์ BY-2 ที่ตายแล้วโดยการย้อม Evans blue เซลล์ BY-2 ที่ได้รับการรักษาด้วย KAND 11 (50 μM หรือ 100 μM) หรือ DMSO ได้รับการตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบสนามสว่าง n=3 มาตราส่วน = 100 µm
การค้นพบและการประยุกต์ใช้ผลิตภัณฑ์ธรรมชาติใหม่ๆ นำไปสู่ความก้าวหน้าครั้งสำคัญในหลากหลายแง่มุมของชีวิตมนุษย์ รวมถึงการแพทย์และการเกษตร มีการวิจัยทางประวัติศาสตร์เพื่อให้ได้สารประกอบที่มีประโยชน์จากทรัพยากรธรรมชาติ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง แอคติโนไมซีตเป็นที่ทราบกันดีว่ามีประโยชน์ในการเป็นยาปฏิชีวนะต้านปรสิตสำหรับไส้เดือนฝอย เนื่องจากความสามารถในการผลิตสารเมแทบอไลต์ทุติยภูมิต่างๆ เช่น อะเวอร์เมกติน ซึ่งเป็นสารประกอบหลักของไอเวอร์เมกติน และบลีโอไมซินและอนุพันธ์ ซึ่งใช้เป็นยาต้านมะเร็ง21,22 เช่นเดียวกัน แอคติโนไมซีตยังค้นพบสารกำจัดวัชพืชหลายชนิด ซึ่งบางชนิดมีการใช้ในเชิงพาณิชย์แล้ว1,23 ดังนั้น การวิเคราะห์สารเมแทบอไลต์ของแอคติโนไมซีตเพื่อแยกผลิตภัณฑ์ธรรมชาติที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพตามที่ต้องการจึงถือเป็นกลยุทธ์ที่มีประสิทธิภาพ ในการศึกษานี้ เราได้ค้นพบสารประกอบใหม่ คือ คูมาโมนาไมด์ จาก S. werraensis และสังเคราะห์ได้สำเร็จ กรดเออร์โซนิกเป็นสารตัวกลางสังเคราะห์ของเออร์เบนาไมด์และอนุพันธ์ กรดเออร์โมโทนิกอาจทำให้เกิดอาการรากม้วนงออันเป็นเอกลักษณ์ มีฤทธิ์กำจัดวัชพืชระดับปานกลางถึงรุนแรง และทำลายไมโครทูบูลของพืชทั้งทางตรงและทางอ้อม อย่างไรก็ตาม กลไกการออกฤทธิ์ของกรดเออร์โมโทนิกอาจแตกต่างจากสารยับยั้งไมโครทูบูลที่มีอยู่ เนื่องจาก KAND 11 ยังทำลายเส้นใยแอคตินและทำให้เซลล์ตาย ซึ่งบ่งชี้ถึงกลไกการควบคุมที่กรดเออร์โมโทนิกและอนุพันธ์มีอิทธิพลต่อโครงสร้างไซโทสเกเลทัลในวงกว้าง
การจำแนกลักษณะเฉพาะของกรดเออร์เบนอนิกอย่างละเอียดจะช่วยให้เข้าใจกลไกการออกฤทธิ์ของกรดเออร์เบนอนิกได้ดียิ่งขึ้น โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เป้าหมายต่อไปคือการประเมินความสามารถของกรดเออร์เบนอนิกในการจับกับไมโครทูบูลที่ลดลง เพื่อพิจารณาว่ากรดเออร์เบนอนิกและอนุพันธ์ของกรดเออร์เบนอนิกออกฤทธิ์โดยตรงกับไมโครทูบูลและทำให้ไมโครทูบูลสลายตัวหรือไม่ หรือการกระทำของกรดเออร์เบนอนิกส่งผลให้ไมโครทูบูลไม่เสถียร นอกจากนี้ ในกรณีที่ไมโครทูบูลไม่ใช่เป้าหมายโดยตรง การระบุตำแหน่งที่ออกฤทธิ์และเป้าหมายระดับโมเลกุลของกรดเออร์เบนอนิกบนเซลล์พืชจะช่วยให้เข้าใจคุณสมบัติของสารประกอบที่เกี่ยวข้องและวิธีการที่เป็นไปได้ในการปรับปรุงฤทธิ์กำจัดวัชพืชได้ดียิ่งขึ้น การทดสอบฤทธิ์ทางชีวภาพของเราเผยให้เห็นความสามารถในการทำลายเซลล์ที่เป็นเอกลักษณ์ของกรดเออร์เบนอนิกต่อการเจริญเติบโตของพืช เช่น อะราบิดอปซิส ทาเลียนา ยาสูบ และลิเวอร์เวิร์ต ในขณะที่เซลล์ของอีโคไลและเซลล์ HeLa ไม่ได้รับผลกระทบ ข้อได้เปรียบของอนุพันธ์ของกรดเออร์เบนอนิกคือความเป็นพิษต่อเซลล์สัตว์น้อยมากหรือแทบไม่มีเลย หากได้รับการพัฒนาเป็นสารกำจัดวัชพืชสำหรับใช้ในไร่นาแบบเปิด อันที่จริง เนื่องจากไมโครทูบูลเป็นโครงสร้างที่พบได้ทั่วไปในยูคาริโอต การยับยั้งแบบเลือกสรรในพืชจึงเป็นข้อกำหนดสำคัญสำหรับสารกำจัดวัชพืช ยกตัวอย่างเช่น โพรพิซาไมด์ ซึ่งเป็นสารดีพอลิเมอร์ไรเซชันของไมโครทูบูลที่จับกับทูบูลินโดยตรงและยับยั้งการเกิดพอลิเมอไรเซชัน ถูกใช้เป็นสารกำจัดวัชพืชเนื่องจากมีความเป็นพิษต่ำต่อเซลล์สัตว์24 เบนซาไมด์ที่เกี่ยวข้องมีความจำเพาะต่อเป้าหมายที่แตกต่างกัน ต่างจากไดโซไพราไมด์ นอกจากไมโครทูบูลของพืชแล้ว RH-4032 หรือเบนโซซาไมด์ยังยับยั้งไมโครทูบูลของเซลล์สัตว์หรือโอโอไมซีตตามลำดับ และซาลิลาไมด์ถูกใช้เป็นสารฆ่าเชื้อราเนื่องจากมีความเป็นพิษต่อพืชต่ำ25,26,27 เซลล์หมีที่เพิ่งค้นพบและอนุพันธ์ของมันแสดงให้เห็นถึงความเป็นพิษต่อเซลล์แบบเลือกสรรต่อพืช แต่ควรสังเกตว่าการดัดแปลงเพิ่มเติมอาจเปลี่ยนแปลงความจำเพาะต่อเป้าหมาย ซึ่งอาจทำให้ได้อนุพันธ์เพิ่มเติมสำหรับการควบคุมเชื้อราหรือโอโอไมซีตที่ทำให้เกิดโรค
คุณสมบัติเฉพาะตัวของกรดเออร์บีโนนิกและอนุพันธ์มีประโยชน์ต่อการพัฒนาเป็นสารกำจัดวัชพืชและใช้เป็นเครื่องมือวิจัย ความสำคัญของโครงร่างเซลล์ในการควบคุมรูปร่างของเซลล์พืชเป็นที่ยอมรับอย่างกว้างขวาง การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าพืชได้พัฒนากลไกที่ซับซ้อนของการจัดเรียงตัวของไมโครทูบูลในคอร์เทกซ์ โดยการควบคุมพลวัตของไมโครทูบูลเพื่อควบคุมการสร้างรูปร่างอย่างเหมาะสม มีการค้นพบโมเลกุลจำนวนมากที่มีหน้าที่ควบคุมการทำงานของไมโครทูบูล และงานวิจัยที่เกี่ยวข้องยังคงดำเนินต่อไป3,4,28 ความเข้าใจในปัจจุบันของเราเกี่ยวกับพลวัตของไมโครทูบูลในเซลล์พืชยังไม่สามารถอธิบายกลไกการจัดเรียงตัวของไมโครทูบูลในคอร์เทกซ์ได้อย่างครบถ้วน ตัวอย่างเช่น แม้ว่าทั้งไดโซไพราไมด์และออไรซาลินจะสามารถสลายตัวของไมโครทูบูลได้ แต่ไดโซไพราไมด์ทำให้เกิดการบิดเบี้ยวของรากอย่างรุนแรง ในขณะที่ออไรซาลินมีผลค่อนข้างน้อย นอกจากนี้ การกลายพันธุ์ในทูบูลิน ซึ่งช่วยรักษาเสถียรภาพของไมโครทูบูล ก็ทำให้เกิดการหมุนแบบเดกซ์โทรในรากเช่นกัน ในขณะที่แพคลิแทกเซล ซึ่งช่วยรักษาเสถียรภาพของพลวัตของไมโครทูบูลเช่นกัน กลับไม่ทำให้เกิดการบิดเบี้ยวของราก ดังนั้น การศึกษาและระบุเป้าหมายระดับโมเลกุลของกรดเออร์โซลิกน่าจะให้ข้อมูลเชิงลึกใหม่ๆ เกี่ยวกับการควบคุมไมโครทูบูลในเปลือกพืช เช่นเดียวกัน การเปรียบเทียบสารเคมีที่มีประสิทธิภาพในการส่งเสริมการเจริญเติบโตที่ผิดเพี้ยนในอนาคต เช่น ไดโซไพราไมด์ กับสารเคมีที่มีประสิทธิภาพน้อยกว่า เช่น ออไรซาลิน หรือกรดคูมาโมเทอริก จะช่วยให้ทราบถึงวิธีการเกิดการเจริญเติบโตที่ผิดเพี้ยน
ในทางกลับกัน การจัดเรียงตัวใหม่ของโครงร่างเซลล์ที่เกี่ยวข้องกับการป้องกันเป็นอีกความเป็นไปได้หนึ่งในการอธิบายความเป็นพิษต่อเซลล์ของกรดเออร์โซนิก การติดเชื้อของเชื้อก่อโรคหรือการนำสารกระตุ้นเข้าสู่เซลล์พืชบางครั้งทำให้โครงร่างเซลล์ถูกทำลายและเซลล์ตายในเวลาต่อมา29 ยกตัวอย่างเช่น มีรายงานว่าคริปโตแซนธินที่ได้จากโอไมซีตสามารถทำลายไมโครทูบูลและเส้นใยแอคตินก่อนการตายของเซลล์ยาสูบ ซึ่งคล้ายกับที่เกิดขึ้นกับการรักษาด้วย KAND30,31 ความคล้ายคลึงกันระหว่างการตอบสนองการป้องกันและการตอบสนองของเซลล์ที่เกิดจากกรดเออร์โซนิกทำให้เราตั้งสมมติฐานว่าสิ่งเหล่านี้กระตุ้นกระบวนการของเซลล์ทั่วไป แม้ว่ากรดเออร์โซนิกจะออกฤทธิ์ได้เร็วกว่าและรุนแรงกว่าคริปโตแซนธินก็ตาม อย่างไรก็ตาม การศึกษาแสดงให้เห็นว่าการถูกทำลายของเส้นใยแอคตินส่งเสริมการตายของเซลล์เอง ซึ่งไม่ได้เกิดขึ้นพร้อมกับการถูกทำลายของไมโครทูบูลเสมอไป29 นอกจากนี้ ยังต้องติดตามดูว่าเชื้อก่อโรคหรือตัวกระตุ้น (elicitor) เป็นสาเหตุที่ทำให้รากเจริญเติบโตผิดรูปหรือไม่ เช่นเดียวกับอนุพันธ์ของกรดเออร์โซนิก ดังนั้น ความรู้เกี่ยวกับโมเลกุลที่เชื่อมโยงการตอบสนองการป้องกันและโครงร่างเซลล์จึงเป็นปัญหาที่น่าสนใจที่ต้องแก้ไข การใช้ประโยชน์จากสารประกอบที่มีน้ำหนักโมเลกุลต่ำที่เกี่ยวข้องกับกรดเออร์โซนิก รวมถึงอนุพันธ์หลากหลายชนิดที่มีศักยภาพแตกต่างกัน อาจเปิดโอกาสให้สามารถกำหนดเป้าหมายกลไกของเซลล์ที่ยังไม่เป็นที่รู้จักได้
เมื่อพิจารณาโดยรวมแล้ว การค้นพบและการประยุกต์ใช้สารประกอบใหม่ๆ ที่ควบคุมพลวัตของไมโครทูบูล จะเป็นวิธีการที่มีประสิทธิภาพในการจัดการกับกลไกโมเลกุลที่ซับซ้อนซึ่งเป็นพื้นฐานของการกำหนดรูปร่างของเซลล์พืช ในบริบทนี้ สารประกอบกรดเออร์โมโทนิกที่พัฒนาขึ้นใหม่ ซึ่งมีผลต่อไมโครทูบูลและเส้นใยแอคติน และกระตุ้นให้เกิดการตายของเซลล์ อาจเป็นโอกาสในการทำความเข้าใจความเชื่อมโยงระหว่างการควบคุมไมโครทูบูลและกลไกอื่นๆ เหล่านี้ ดังนั้น การวิเคราะห์ทางเคมีและชีวภาพโดยใช้กรดเออร์บีโนนิกจะช่วยให้เราเข้าใจกลไกการควบคุมโมเลกุลที่ควบคุมโครงร่างเซลล์ของพืช
เพาะเชื้อ S. werraensis MK493-CF1 ลงในขวด Erlenmeyer แบบมีแผ่นกั้นขนาด 500 มล. ซึ่งบรรจุอาหารเพาะเชื้อ 110 มล. ประกอบด้วยกาแลคโตส 2% (w/v), เอสเซนเชียลเพสต์ 2% (w/v), แบคทีเรีย 1% (w/v) ถั่วเหลือง (Thermo Fisher Scientific, Inc.), สารสกัดจากข้าวโพด 0.5% (w/v) (KOGOSTCH Co., Ltd., ญี่ปุ่น), (NH4)2SO4 0.2% (w/v) และ CaCO3 0.2% ในน้ำปราศจากไอออน (pH 7.4 ก่อนฆ่าเชื้อ) เพาะเชื้อบนเครื่องเขย่าแบบหมุน (180 รอบต่อนาที) ที่อุณหภูมิ 27°C เป็นเวลา 2 วัน เพาะเลี้ยงเพื่อการผลิตโดยใช้กระบวนการหมักแบบของแข็ง ย้ายเชื้อเพาะเมล็ด (7 มล.) ลงในขวด K-1 ขนาด 500 มล. ที่บรรจุอาหารเลี้ยงเชื้อ 40 กรัม ประกอบด้วยข้าวบาร์เลย์อัด 15 กรัม (บริษัท MUSO Co., Ltd. ประเทศญี่ปุ่น) และน้ำดีไอออนไนซ์ 25 กรัม (ไม่ได้ปรับค่า pH ก่อนฆ่าเชื้อ) หมักที่อุณหภูมิ 30°C ในที่มืดเป็นเวลา 14 วัน สกัดสารที่ใช้หมักด้วย EtOH 40 มล./ขวด แล้วปั่นเหวี่ยง (1500 กรัม, 4°C, 10 นาที) สกัดสารละลายส่วนบน (60 มล.) ด้วยส่วนผสมของ MeOH/EtOAc 10% ชั้นอินทรีย์ระเหยภายใต้ความดันที่ลดลงเพื่อให้ได้สารตกค้าง (59.5 มก.) ซึ่งจะถูกทำให้ร้อนด้วย HPLC ด้วยการชะแบบไล่ระดับ (0–10 นาที: 90%) บนคอลัมน์เฟสแบบย้อนกลับ (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 มม. × ความยาว 250 มม.) H2O/CH3CN, 10–35 นาที: 90% H2O/CH3CN ถึง 70% H2O/CH3CN (ไล่ระดับ) 35–45 นาที: 90% H2O/EtOH, 45–155 นาที: 90% H2O/EtOH ถึง 100% EtOH (ไล่ระดับ (ไล่ระดับ) 155–200 นาที: 100% EtOH) ที่อัตราการไหล 1.5 มล./นาที แยกคูมาโมนาไมด์ (1, 36.0 มก.) ออกมาเป็นผงอสัณฐานสีขาว
Kumamotoamide(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t , J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ ค่าที่คำนวณได้: 141.0659, ค่าที่วัดได้: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1
เมล็ดพันธุ์โคลัมเบีย (Col-0) ได้รับจากศูนย์ทรัพยากรชีวภาพ Arabidopsis (ABRC) โดยได้รับอนุญาตให้ใช้ในการวิจัย เมล็ดพันธุ์ Col-0 ได้รับการขยายพันธุ์และบำรุงรักษาภายใต้สภาพห้องปฏิบัติการของเรา และใช้เป็นพืช Arabidopsis ชนิดป่า เมล็ดพันธุ์ Arabidopsis ได้รับการฆ่าเชื้อบนพื้นผิวและเพาะเลี้ยงในอาหาร Murashige และ Skoog แบบครึ่งความเข้มข้นที่ประกอบด้วยซูโครส 2% (Fujifilm Wako Pure Chemical), 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) 0.05% (w/v) (Fujifilm Wako Pure Chemical) และวุ้น 1.5% (Fujifilm Wako Pure Chemical) ค่า pH 5.7 ที่อุณหภูมิ 23 องศาเซลเซียส และแสงคงที่ เมล็ดพันธุ์กลายพันธุ์ phs1-1 ได้รับจาก T. Hashimoto (สถาบันวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีนารา)
เมล็ดพันธุ์สายพันธุ์ SR-1 ได้รับจาก T. Hashimoto (สถาบันวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีนารา) และใช้เป็นพืชยาสูบพันธุ์ป่า เมล็ดยาสูบถูกฆ่าเชื้อบนพื้นผิวและแช่ในน้ำปลอดเชื้อเป็นเวลาสามคืนเพื่อส่งเสริมการงอก จากนั้นนำไปแช่ในสารละลายความเข้มข้นครึ่งหนึ่งที่ประกอบด้วยซูโครส 2%, MES 0.05% (w/v) และเจลแลนกัม 0.8% (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. และ Skoog medium ที่มีค่า pH 5.7 และบ่มที่อุณหภูมิ 23°C ภายใต้แสงคงที่
สายพันธุ์ Tak-1 ได้รับจาก T. Kohchi (มหาวิทยาลัยเกียวโต) และใช้เป็นหน่วยทดลองมาตรฐานสำหรับการศึกษาลิเวอร์เวิร์ต Gemma ได้มาจากพืชเพาะเลี้ยงที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว จากนั้นนำไปเพาะบนอาหาร Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) ที่มีซูโครส 1% และเจลแลนกัม 0.3% แล้วบ่มที่อุณหภูมิ 23°C ภายใต้แสงต่อเนื่อง
เซลล์ BY-2 จากยาสูบ (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) จัดทำโดย S. Hasezawa (มหาวิทยาลัยโตเกียว) เซลล์ BY-2 ถูกเจือจาง 95 เท่าในอาหารเลี้ยงเชื้อ Linsmeier และ Skoog ที่ผ่านการดัดแปลง และเสริมด้วยกรด 2,4-dichlorophenoxyacetic 32 ทุกสัปดาห์ เซลล์ที่แขวนลอยถูกผสมบนเครื่องเขย่าแบบหมุนที่ความเร็ว 130 รอบต่อนาที ที่อุณหภูมิ 27°C ในที่มืด ล้างเซลล์ด้วยปริมาตร 10 เท่าของอาหารเลี้ยงเชื้อใหม่ และแขวนลอยใหม่ในอาหารเลี้ยงเชื้อเดียวกัน เซลล์สายพันธุ์ BY-2 ทรานสเจนิกที่แสดงเครื่องหมายไมโครทูบูล TagRFP-TUA6 หรือเครื่องหมายเส้นใยแอคติน GFP-ABD2 อย่างเสถียรภายใต้โปรโมเตอร์ 35S ของไวรัสโมเสกดอกกะหล่ำ ถูกสร้างขึ้นตามที่อธิบายไว้33,34,35 เซลล์สายพันธุ์เหล่านี้สามารถคงสภาพและซิงโครไนซ์ได้โดยใช้วิธีการที่คล้ายคลึงกับที่ใช้กับเซลล์สายพันธุ์ BY-2 ดั้งเดิม
เซลล์ HeLa ได้รับการเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies) ที่เสริมด้วยซีรั่มวัวจากตัวอ่อน 10% เพนิซิลลิน 1.2 U/ml และสเตรปโตมัยซิน 1.2 μg/ml ในตู้ฟักที่อุณหภูมิ 37°C ที่มี CO2 5%
การทดลองทั้งหมดที่อธิบายไว้ในต้นฉบับนี้ดำเนินการตามกฎระเบียบและแนวทางด้านความปลอดภัยทางชีวภาพของญี่ปุ่น
สารประกอบถูกละลายในไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) เป็นสารละลายพื้นฐาน และเจือจางในอาหาร MS สำหรับ Arabidopsis และอาหารยาสูบ หรืออาหาร Gamborg B5 สำหรับ liverwort สำหรับการทดสอบการยับยั้งการเจริญเติบโตของราก เมล็ดมากกว่า 10 เมล็ดต่อจานเพาะถูกหว่านบนอาหารวุ้นที่มีสารประกอบที่ระบุหรือ DMSO เมล็ดถูกบ่มเพาะในห้องเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 7 วัน ถ่ายภาพต้นกล้าและวัดความยาวของราก สำหรับการทดสอบการงอกของ Arabidopsis เมล็ด 48 เมล็ดต่อจานเพาะถูกหว่านบนอาหารวุ้นที่มีสารประกอบหรือ DMSO ความเข้มข้น 200 ไมโครโมลาร์ เมล็ด Arabidopsis ถูกเพาะในห้องเพาะเลี้ยงและนับจำนวนต้นกล้าที่งอกหลังจากงอก 7 วัน (dag) สำหรับการทดสอบการงอกของยาสูบ เมล็ด 24 เมล็ดต่อจานเพาะถูกหว่านบนอาหารวุ้นที่มี KAND หรือ DMSO ความเข้มข้น 200 ไมโครโมลาร์ เมล็ดยาสูบถูกปลูกในห้องเพาะเลี้ยง และนับจำนวนต้นกล้าที่งอกหลังจาก 14 วัน สำหรับการทดสอบการยับยั้งการเจริญเติบโตของลิเวอร์เวิร์ต เอ็มบริโอ 9 ตัวจากแต่ละเพลตถูกเพาะบนอาหารวุ้นที่มีความเข้มข้นของ KAND หรือ DMSO ตามที่ระบุไว้ และบ่มเพาะในห้องเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 14 วัน
ใช้ต้นกล้าที่ย้อมด้วยโพรพิดิอัมไอโอไดด์ (PI) ความเข้มข้น 5 มก./มล. เพื่อดูโครงสร้างเนื้อเยื่อเจริญของราก สังเกตสัญญาณ PI ด้วยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์โดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบเลเซอร์สแกนคอนโฟคัล TCS SPE (Leica Microsystems)
การย้อมสีรากด้วยเอนไซม์ β-glucuronidase (GUS) ทางฮิสโตเคมี ดำเนินการตามโปรโตคอลที่ Malami และ Benfey36 อธิบายไว้ ต้นกล้าถูกตรึงในอะซิโตน 90% ข้ามคืน ย้อมด้วยกรด 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic ความเข้มข้น 0.5 มก./มล. ในบัฟเฟอร์ GUS เป็นเวลา 1 ชั่วโมง แล้วนำไปแช่ในสารละลายคลอเรลดีไฮด์ไฮเดรต (คลอเรลไฮเดรต 8 กรัม น้ำ 2 มล. และกลีเซอรอล 1 มล.) และสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนทราสต์แบบดิฟเฟอเรนเชียลอินเทอร์เฟอเรนซ์โดยใช้กล้องจุลทรรศน์ Axio Imager M1 (Carl Zeiss)
วัดมุมรากของต้นกล้าอายุ 7 วันที่ปลูกบนจานปลูกแนวตั้ง วัดมุมรากจากทิศทางของเวกเตอร์แรงโน้มถ่วงตามที่อธิบายไว้ในขั้นตอนที่ 6
การจัดเรียงตัวของไมโครทูบูลในคอร์เทกซ์เป็นไปตามที่อธิบายไว้ โดยมีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อยในโปรโตคอล 37 ใช้แอนติบอดีต่อเบตาทูบูลิน (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) และแอนติบอดีต่อเมาส์ IgG ที่จับคู่ Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) เป็นแอนติบอดีปฐมภูมิและทุติยภูมิที่ความเข้มข้น 1:1000 และ 1:100 ตามลำดับ บันทึกภาพเรืองแสงโดยใช้กล้องจุลทรรศน์เลเซอร์สแกนแบบคอนโฟคอล TCS SPE (Leica Microsystems) บันทึกภาพ Z-stack และสร้างภาพฉายที่มีความเข้มสูงสุดตามคำแนะนำของผู้ผลิต
การทดสอบการแพร่กระจายของเซลล์ HeLa ดำเนินการโดยใช้ Cell Counting Kit 8 (Dojindo) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต
การเจริญเติบโตของ E. coli DH5α ได้รับการวิเคราะห์โดยการวัดความหนาแน่นของเซลล์ในวัฒนธรรมโดยใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ที่ 600 นาโนเมตร (OD600)
การจัดระเบียบโครงร่างเซลล์ในเซลล์ BY-2 ทรานส์เจนิกถูกสังเกตโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ที่ติดตั้งอุปกรณ์สแกนคอนโฟคัล CSU-X1 (Yokogawa) และกล้อง sCMOS (Zyla, Andor Technology) ความหนาแน่นของโครงร่างเซลล์ถูกประเมินโดยการวิเคราะห์ภาพ ซึ่งวัดเปอร์เซ็นต์ของพิกเซลโครงร่างเซลล์ในบรรดาพิกเซลไซโตพลาสซึมในภาพคอนโฟคัลโดยใช้ซอฟต์แวร์ ImageJ ตามที่อธิบายไว้38,39
เพื่อตรวจหาการตายของเซลล์ในเซลล์ BY-2 เซลล์ที่ถูกแขวนลอยบางส่วนถูกบ่มด้วย Evans blue ความเข้มข้น 0.05% เป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง การย้อมสี Evans blue แบบเลือกเฉพาะเซลล์ที่ตายแล้วขึ้นอยู่กับการขับสีย้อมออกจากเซลล์ที่มีชีวิตโดยเยื่อหุ้มพลาสมาที่สมบูรณ์40 เซลล์ที่ถูกย้อมสีถูกสังเกตโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบสนามสว่าง (BX53, Olympus)
เซลล์ HeLa ถูกเพาะเลี้ยงใน DMEM ที่เสริมด้วย FBS 10% ในตู้บ่มเพาะแบบมีความชื้นที่อุณหภูมิ 37°C และ CO2 5% เซลล์ถูกทำให้เย็นด้วย KAND 11 ความเข้มข้น 100 ไมโครโมลาร์, กรดคูมาโมนามิก 6, คูมาโมนาไมด์ 1, คอลเซมิด (Gibco) ความเข้มข้น 100 นาโนกรัม/มิลลิลิตร หรือโนคอดเมซ (Sigma) ความเข้มข้น 100 นาโนกรัม/มิลลิลิตร เป็นเวลา 6 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37°C ตรึงเซลล์ด้วย MetOH เป็นเวลา 10 นาที จากนั้นตรึงด้วยอะซิเตตเป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้อง เซลล์ที่ถูกตรึงถูกบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิ β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) ที่เจือจางใน 0.5% BSA/PBS เป็นเวลา 2 ชั่วโมง ล้างด้วย TBST 3 ครั้ง แล้วบ่มด้วยแอนติบอดีแพะ Alexa Fluor 488 1 ชั่วโมง – Mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) และ 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 15 นาโนกรัม/มิลลิลิตร เจือจางใน BSA/PBS 0.5% หลังจากล้างด้วย TBST สามครั้ง เซลล์ที่ย้อมสีถูกสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบกลับหัว Nikon Eclipse Ti-E ภาพถูกบันทึกด้วยกล้อง CCD Hamamatsu ORCA-R2 ที่ทำความเย็นแล้ว โดยใช้ซอฟต์แวร์ MetaMorph (Molecular Devices)